揭示水楊酸甲酯介導(dǎo)的植物氣傳性免疫的分子機(jī)制及病毒的反防御機(jī)制
文獻(xiàn)背景
植物受到環(huán)境刺激時(shí)會(huì)釋放揮發(fā)性化合物（vocs）作為植物間的特殊溝通信號(hào)而被感知，進(jìn)而誘導(dǎo)鄰近植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為氣傳性免疫（airborne defense，ad）。盡管幾十年來(lái)在眾多植物中已觀察到這種植物間通訊（ppc）現(xiàn)象，并了解其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)意義，然而包括ad在內(nèi)的vocs介導(dǎo)的ppc的分子機(jī)制仍不清楚。此外，除乙烯受體外，植物中介導(dǎo)voc傳感系統(tǒng)的受體也一直未確定。
蚜蟲(chóng)是具破壞性的農(nóng)業(yè)和園藝害蟲(chóng)，以韌皮部為食，超過(guò)40%的植物病毒依靠蚜蟲(chóng)傳播來(lái)感染植物，因此對(duì)作物生產(chǎn)造成了大規(guī)模的破壞。蚜蟲(chóng)侵害會(huì)誘導(dǎo)植物釋放包含水楊酸甲酯（mesa）、水楊酸結(jié)合蛋白-2（sabp2）、轉(zhuǎn)錄因子nac2和水楊酸-羧甲基轉(zhuǎn)移酶-1（samt1）在內(nèi)的vocs。mesa在植物防御蚜蟲(chóng)等草食性昆蟲(chóng)侵害中發(fā)揮重要作用，包括驅(qū)除昆蟲(chóng)、吸引捕食者或降低昆蟲(chóng)的生存適應(yīng)性等方式。mesa被認(rèn)為是植物內(nèi)部和長(zhǎng)距離移動(dòng)信號(hào)，參與誘導(dǎo)對(duì)微生物病原體和食草昆蟲(chóng)的系統(tǒng)獲得性抗性（sar）。在sar過(guò)程中，水楊酸（sa）在病原體感染的細(xì)胞中積累，并通過(guò)samt1轉(zhuǎn)化為mesa；然后，mesa通過(guò)韌皮部進(jìn)入遠(yuǎn)端組織，隨后在未侵染葉中被sabp2重新轉(zhuǎn)化為sa。雖然已知mesa作為植物內(nèi)sar信號(hào)的功能，但mesa如何作為植物間通訊的信號(hào)激活ad抗蚜蟲(chóng)防御是一個(gè)長(zhǎng)期未解決的問(wèn)題。植物是否擁有識(shí)別和感知空氣中mesa的受體也不清楚。此外，蚜蟲(chóng)和病毒能否干擾植物氣傳性免疫也未知。本研究揭示了ad的分子機(jī)制和蚜蟲(chóng)-病毒共同進(jìn)化的共生關(guān)系，證明ad是控制蚜蟲(chóng)和病毒的潛在仿生策略。
基本信息
題目：molecular basis of methyl-salicylatemediated plant airborne defence
期刊：
nature
影響因子：64.8
通訊作者：
劉玉樂(lè)
作者單位：
清華大學(xué)等
索萊寶合作產(chǎn)品：
產(chǎn)品貨號(hào)
產(chǎn)品名稱(chēng)
ib0100
6-芐氨基喋呤（6-ba）
ia1310
腺苷-5'-三磷酸
n8010
α-萘乙酸（naa）
摘要蚜蟲(chóng)是具破壞性的作物害蟲(chóng)之一，被蚜蟲(chóng)侵害的植物會(huì)釋放揮發(fā)性化合物，以引起鄰近植物的氣傳性免疫（ad）。本文揭示了mesa、sabp2、轉(zhuǎn)錄因子nac2和samt1形成了信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)鄰近植物針對(duì)蚜蟲(chóng)和病毒的ad。空氣中mesa能夠被mesa受體蛋白水楊酸結(jié)合蛋白-2（sa-binding protein-2，sabp2）感知并轉(zhuǎn)化為水楊酸（salicylic acid, sa）。水楊酸引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，sa激活轉(zhuǎn)錄因子nac2，上調(diào)水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶1（sa-carboxylmethyltransferase-1，samt1）基因的表達(dá)，激活nac2-samt1模塊從而產(chǎn)生更多的mesa，誘導(dǎo)植物的抗蚜蟲(chóng)免疫，從而降低病毒的傳播。一些蚜蟲(chóng)傳播病毒比如黃瓜花葉病毒、馬鈴薯y病毒等能夠編碼含有解旋酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，通過(guò)與nac2蛋白相互作用來(lái)抑制ad，改變nac2蛋白的亞細(xì)胞定位，促進(jìn)nac2在細(xì)胞質(zhì)中被26s蛋白酶體降解，從而負(fù)調(diào)控nac2-samt1通路，抑制mesa的合成和揮發(fā)，阻斷植物間“預(yù)警通訊，促進(jìn)蚜蟲(chóng)對(duì)鄰近植物的侵染和對(duì)病毒的傳播。本研究揭示了ad的分子機(jī)制和蚜蟲(chóng)-病毒共同進(jìn)化的共生關(guān)系，表明ad是一種潛在的生物仿生策略，可以控制蚜蟲(chóng)和病毒的傳播。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
1. 驗(yàn)證植物抗病毒防御需要nac2作者通過(guò)免疫沉淀-質(zhì)譜分析策略（ip-ms），成功鑒定了本氏豬籠草中黃瓜花葉病毒（cmv）的病毒發(fā)病機(jī)制過(guò)程中，核心蛋白cmv1a的相互作用蛋白組，并確定nac2為cmv1a的重要相互作用因子，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a）。cmv1a-nac2相互作用通過(guò)免疫共沉淀（co-ip）、雙分子熒光（bifc）和熒光素酶互補(bǔ)成像（lci）試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1b-d）。為了評(píng)估nac2是否影響cmv對(duì)nac2.1/nac2.2雙敲除（ko）突變株的感染，通過(guò)比較crispr-cas9基因編輯（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a）產(chǎn)生的突變株（nac2植株）和野生型（wt株）的感染結(jié)果，發(fā)現(xiàn)cmv感染導(dǎo)致nac2突變株的癥狀更嚴(yán)重，病毒rna和外殼蛋白（cp）的量更高（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1e-g）。用gfp標(biāo)記的馬鈴薯病毒y或gfp標(biāo)記的tmv（tmv-gfp）感染的突變株和野生型植株中也有類(lèi)似的結(jié)果（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1h-m）。這些數(shù)據(jù)表明，nac2對(duì)植物抗病毒防御至關(guān)重要。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1
2. 證明nac2通過(guò)mesa介導(dǎo)ad對(duì)抗蚜蟲(chóng)
作者在研究中注意到，在nac2葉子上定植的綠桃蚜蟲(chóng)數(shù)量比在wt葉子上的數(shù)量多得多，進(jìn)一步研究了nac2植株對(duì)蚜蟲(chóng)吸引力的作用。作者進(jìn)行了圓形培養(yǎng)皿和y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)nac2植株比wt植株吸引了更多的蚜蟲(chóng)，推測(cè)這可能是由空氣傳播信號(hào)介導(dǎo)的（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1n-o）。作者使用氣相色譜法與ms（gc-ms）相結(jié)合來(lái)鑒定蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株與nac2植株釋放的揮發(fā)物。而mesa是蚜蟲(chóng)侵襲wt植株與nac2植株產(chǎn)生差異的voc，并且蚜蟲(chóng)侵染后wt釋放的mesa多于nac2植株（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2e-h）。mesa是有據(jù)可查的可誘發(fā)蚜蟲(chóng)的voc10-13主要揮發(fā)物。為了測(cè)試nac2植株對(duì)蚜蟲(chóng)吸引力的影響是否歸因于mesa的揮發(fā)，研究人員使用gc-ms測(cè)量了對(duì)蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株在空氣中mesa的排放率，發(fā)現(xiàn)每個(gè)蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株mesa的排放率為34ng h?1（相當(dāng)于每天排放0.816µg）（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2f）。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，含有0.8µg mesa/羊毛脂處理的植株與蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株有相似的mesa排放（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2i，j）。因此，研究人員使用0.8µg mesa/羊毛脂涂抹對(duì)植株進(jìn)行處理，結(jié)果表明nac2和wt植株對(duì)蚜蟲(chóng)表現(xiàn)出相似的吸引力（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1p，q）。然而，當(dāng)單獨(dú)用羊毛脂或羊毛脂與其他揮發(fā)物（如3,3-二甲基己烷）處理時(shí)，nac2植株比wt植株對(duì)蚜蟲(chóng)更具吸引力（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1r，s）。研究人員將nac2和wt植株置于揮發(fā)性mesa下24 h，然后通風(fēng)2h，并比較了氣態(tài)mesa如何影響植株對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力。在這樣的條件下，wt植株對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避性更強(qiáng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1t，u）。然而，在通風(fēng)和不進(jìn)行揮發(fā)性mesa處理后，nac2植株之間的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性沒(méi)有明顯差異（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1v，w）。此外，與未進(jìn)行mesa處理時(shí)觀察到的情況一樣，在mesa處理下，與揮發(fā)性mesa處理隨后通風(fēng)的wt植株相比，nac2植株對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力仍然更大（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 1x，y）。
為了解釋這種現(xiàn)象背后的原因（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1t-y），研究人員用揮發(fā)性mesa處理nac2或wt植株24 h，然后通風(fēng)，量化接收植株（接收器）排放的揮發(fā)性mesa。wt植株反而在空氣中釋放出更高水平的mesa（圖1a，b）。隨后研究人員比較了蚜蟲(chóng)mesa接收植株與模擬wt植株在涂抹后的吸引力，所有植株都含有mesa/羊毛脂，但發(fā)現(xiàn)它們?cè)谘料x(chóng)偏好方面沒(méi)有差異（圖1c，d）。此外，在用mesa/羊毛脂涂抹nac2和wt接收植株后，這些mesa接收植株還同樣吸引蚜蟲(chóng)（圖1e，f）。接下來(lái)，研究人員以蚜蟲(chóng)侵襲的植物為發(fā)射植株（發(fā)生源），研究了nac2植株在自然露天環(huán)境下ad的作用（圖3a）。在被吸汁蚜蟲(chóng)感染后，wt植株不斷排放voc mesa（圖1g，h）。值得注意的是，nac2接收植株釋放的mesa波動(dòng)性較低，但是當(dāng)發(fā)生源受到蚜蟲(chóng)攻擊時(shí)，與wt接收植株相比，其表現(xiàn)出對(duì)蚜蟲(chóng)更高的吸引力（圖1i-l）。與鄰近的模擬發(fā)射植株相比，受蚜蟲(chóng)侵染的wt相鄰接收植株對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避性更強(qiáng)，而與模擬蚜蟲(chóng)攻擊發(fā)射植株相鄰的nac2接收植株之間的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性沒(méi)有顯著差異（圖1m，n）。此外，在以接收植株喂食24小時(shí)后，wt中的蚜蟲(chóng)存活率降低，但nac2接收植株的存活率沒(méi)有降低（圖 1o，p）。這些結(jié)果表明，一旦感知到mesa，鄰近接收植株中的mesa生物合成是以nac2依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)進(jìn)而介導(dǎo)可對(duì)抗蚜蟲(chóng)的ad。 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2 圖1
3.nac2激活samt1轉(zhuǎn)錄
接下來(lái)，研究人員開(kāi)始探索nac2和mesa生物合成之間的分子遺傳機(jī)制。nac2作為轉(zhuǎn)錄因子（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b），可以定位于細(xì)胞核中（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c）。隨后，研究人員對(duì)有和沒(méi)有蚜蟲(chóng)喂食的wt和nac2植株進(jìn)行了rna測(cè)序（rna-seq）和比較轉(zhuǎn)錄組分析，并鑒定了許多潛在的nac2調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4和補(bǔ)充表1和2），其中samt1的結(jié)果特別令人感興趣（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4e）。無(wú)論這些植物是否受到蚜蟲(chóng)的侵襲，nac2植株的samt1 rna水平都低于wt植株（補(bǔ)充表1和2）。samt1將sa轉(zhuǎn)化為mesa19，研究人員通過(guò)定量研究nac2、ha-nac2過(guò)表達(dá)和wt植株葉片組織中的samt1轉(zhuǎn)錄本，以評(píng)估nac2是否通過(guò)調(diào)節(jié)samt1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明，與wt植株相比，nac2植株的samt1 mrna水平顯著降低，但ha-nac2過(guò)表達(dá)植株的samt1 mrna水平升高（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3d，e）。此外，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，nac2增強(qiáng)了samt1啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3f）。chip–qpcr、酵母單雜交和emsa分析均表明，nac2與samt1啟動(dòng)子結(jié)合，并激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3g-i）。此外，nac2的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)增加了植物mesa的產(chǎn)生（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 3j）。這些結(jié)果表明，nac2-samt1模塊與植物mesa生物合成的調(diào)控有關(guān)。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4
4. sa激活nac2-samt1模塊引發(fā)ad
為了研究nac2是否通過(guò)激活samt1轉(zhuǎn)錄影響接收植株mesa的產(chǎn)生，研究人員評(píng)估了不同處理?xiàng)l件下突變株nac2、nahg和wt植株中的nac2和samt1的mrna水平（圖 2f）。蚜蟲(chóng)侵襲后，wt和nac2植株的sa水平升高程度相近，然而，細(xì)胞mesa和samt表達(dá)的增加僅在wt植株中發(fā)現(xiàn)（圖2e-g）。在wt接收植株和nac2接收植株鄰近蚜蟲(chóng)侵襲植株中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果（圖 2h-j）。這些結(jié)果表明，nac2是蚜蟲(chóng)定向誘導(dǎo)或蚜蟲(chóng)介導(dǎo)的samt1表達(dá)和揮發(fā)性mesa產(chǎn)生所必需的。此外，外源性sa上調(diào)了nac2和samt1在wt植株中的表達(dá)，但在nac2突變株中samt1 mrna的表達(dá)水平未顯著改變（圖 2k，l）。與nac2突變株相比，外源性sa也誘導(dǎo)wt植株的mesa揮發(fā)性和蚜蟲(chóng)驅(qū)避性（圖2m–p），并增加samt1-ko植株中nac2和samt1轉(zhuǎn)錄本的水平（圖 2q；圖2b，c），samt1植株對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力也更強(qiáng)，而且在samt1植株中外源性sa不誘導(dǎo)蚜蟲(chóng)驅(qū)避（圖2r-t）。此外，暴露于蚜蟲(chóng)侵襲的samt1植株中揮發(fā)性mesa的產(chǎn)生減少（圖3a，b），在進(jìn)一步的蚜蟲(chóng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)與鄰近模擬的wt接收植株相比，鄰近蚜蟲(chóng)侵襲的wt發(fā)射植株的wt接收植株對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避性更強(qiáng)，然而，無(wú)論何時(shí)將這些發(fā)射植株暴露于蚜蟲(chóng)侵襲中，與nac2或samt1發(fā)射植株相鄰的wt接收植株在蚜蟲(chóng)驅(qū)避性方面都沒(méi)有顯著差異（圖3c-e）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了mesa作為植物ad中ppc信號(hào)的作用。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明sa可以激活nac2-samt1轉(zhuǎn)錄進(jìn)而增加發(fā)射和接收植株中揮發(fā)性mesa的產(chǎn)生。
作為一種sa結(jié)合蛋白，sabp2也可以與mesa結(jié)合，這對(duì)于細(xì)胞內(nèi)mesa轉(zhuǎn)化為sa至關(guān)重要。因此，sabp2可以作為一種obp樣受體，感知并將發(fā)射植株產(chǎn)生的揮發(fā)狀態(tài)mesa轉(zhuǎn)化為sa以觸發(fā)nac2介導(dǎo)的接收植株中的蚜蟲(chóng)抗性。為了驗(yàn)證這一想法，研究人員首先確認(rèn)sabp2與sa結(jié)合（圖3f），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mesa是否影響sabp2-sa的結(jié)合活性（圖3g）。在無(wú)mesa的情況下，sabp2-[3h]sa（50 ci mmol?1）結(jié)合力為100%。然而，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，3nm和15nm的mesa，sabp2對(duì)[3h]sa的結(jié)合活性分別降低到約74%和46%（圖3g）。因此，3nm的mesa足以滿(mǎn)足用于[3h]sa與sabp2的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，表明mesa可以以生理濃度與sabp2結(jié)合。隨后，研究人員建立了sabp2-ko突變株（sabp2），并測(cè)試了sabp2突變株與wt植株的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性，用揮發(fā)性的mesa處理，然后進(jìn)行通氣，揮發(fā)性的mesa處理可增加wt的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性和sa生物合成，但對(duì)于sabp2突變株并沒(méi)有增加（圖3h-j和擴(kuò)展圖2d）。此外，蚜蟲(chóng)喂食wt發(fā)射植株增加了wt植株的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性，但sabp2未增加（圖3k）。此外，外源性的sa對(duì)wt和sabp2植株的mesa揮發(fā)性無(wú)顯著差異，表明sabp2對(duì)mesa的釋放不是必須的（圖3l，m）。這些結(jié)果表明，sabp2確實(shí)是一種obp樣受體，可以感知并將空氣中的mesa轉(zhuǎn)化為sa，引起nac2介導(dǎo)的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性。
samt1是植物抗病毒免疫所必需的。為了測(cè)試samt1是否為nac2介導(dǎo)的植物抗病毒免疫中的一個(gè)組成部分。研究人員敲低（kd）samt1植株中的nac2，使用基于煙草脆裂病毒（trv）誘導(dǎo)的基因沉默產(chǎn)生nac2/samt1雙突變植株。與nac2突變株一樣，nac2-kd植株表現(xiàn)出正常生長(zhǎng)，和對(duì)cmv和pvy的高易感性（圖1e-j，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a-e，h-l），表明病毒誘導(dǎo)的基因沉默nac2-kd與nac2-ko株有相似性。然而，nac2/samt1和samt1植株表現(xiàn)出相似程度的cmv或pvy易感性（圖 5a-e，h-l）。此外，cmv感染增強(qiáng)了植物細(xì)胞內(nèi)mesa水平（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5f）。在病毒感染期間，nac2-kd、samt1和nac2/samt1植株的未侵襲葉片產(chǎn)生相似數(shù)量的mesa，但與wt植株相比，數(shù)量較低（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5g）。此外，作者還研究了外源性mesa或sa在nac2、sabp2、samt1和wt不同植株中，mesa是否以及如何通過(guò)nac2介導(dǎo)植物抗病毒防御。與wt植株相比，nac2、samt1和sabp2植株對(duì)cmv和pvy更易感（圖3n，o）。然而，外源性mesa可以降低nac2和samt1植株的病毒易感性，但對(duì)sabp2植株無(wú)效（圖 3n，o），可能是由于wt、nac2和samt1植株中的mesa轉(zhuǎn)化為 sa。外噴sa也可以降低nac2、samt1和sabp2植株的病毒易感性（圖3n，o）。這與以下事實(shí)一致：sa可以抑制多種病毒對(duì)植物的感染，包括cmv、馬鈴薯病毒x和tmv。
綜上所述，mesa結(jié)合蛋白sabp2能夠在結(jié)合mesa時(shí)，將細(xì)胞間的mesa轉(zhuǎn)化成sa。由此實(shí)現(xiàn)信號(hào)的發(fā)起。隨后sa激活nac2-samt1模塊，以此上調(diào)內(nèi)源mesa水平，促進(jìn)nac2依賴(lài)性samt1的轉(zhuǎn)錄與翻譯。
圖2 圖3 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖55. cmv1a破壞nac2的穩(wěn)定性以抑制ad
研究表明cmv感染可以抑制蚜蟲(chóng)誘導(dǎo)的ad（圖4a），從而有利于蚜蟲(chóng)的生存和病毒的傳播與感染，可能是通過(guò)cmv介導(dǎo)mesa所致。cmv1a-nac2相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a-d）表明cmv1a可能參與cmv介導(dǎo)的ad抑制。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，首先生成了表達(dá)cmv1a的轉(zhuǎn)基因煙草植物（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a，b），并評(píng)估了cmv1a對(duì)植物、蚜蟲(chóng)和ad吸引力的影響。圓形培養(yǎng)皿和y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定表明，cmv1a表達(dá)導(dǎo)致植物對(duì)蚜蟲(chóng)具有更高的吸引力（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 6c，d）。表明cmv1a參與cmv介導(dǎo)的ad抑制。
為了了解 cmv1a-nac2相互作用在cmv介導(dǎo)的ad抑制中的重要性，研究人員鑒定了cmv1a中與nac2相互作用的關(guān)鍵氨基酸。cmv1a由n端甲基轉(zhuǎn)移酶和c端atp依賴(lài)性解旋酶結(jié)構(gòu)域（hd）組成。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)cmv1a hd是cmv1a-nac2相互作用的主要區(qū)域（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6l）。隨后，研究人員使用alpha fold-multimer27模擬了cmv1a-nac2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并觀察到 cmv1a中983位的甘氨酸殘基與nac2物理距離最近，預(yù)測(cè)該殘基可能是cmv1a與nac2相互作用所必需的（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6m，n）。cmv1a hd或全長(zhǎng)cmv1a中的g983d突變嚴(yán)重降低了cmv1a-nac2的相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 6o-q）。
接下來(lái)，研究人員使用bifc研究了cmv1a-nac2相互作用的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)cmv1a在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都與nac2相互作用（圖1c），這與沒(méi)有cmv1a共表達(dá)的nac2定位不同（圖3c），表明cmv1a可以將一些nac2從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。類(lèi)似的還有cmv1a–myc，但是cluc–myc和cmv1a（g983d）-myc均未出現(xiàn)這種現(xiàn)象，這或許可以解釋引起部分rfp-nac2的細(xì)胞質(zhì)定位和細(xì)胞核中較少的rfp熒光（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 7a）。值得注意的是，cmv1a-myc沒(méi)有改變r(jià)fp核定位，表明cmv1a-myc定向nac2的重新定位取決于nac2-cmv1a相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7b）。此外，研究人員使用核輸出信號(hào)（nes）標(biāo)記的nac2研究了細(xì)胞質(zhì)nac2的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)nes-nac2定位于細(xì)胞質(zhì)中，nac2易被26s-蛋白酶體系統(tǒng)降解（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7c，d）。此外，瞬時(shí)cmv1a表達(dá)增強(qiáng)了26s-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)nac2的降解，但不影響rfp穩(wěn)定性（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 7e-i），而cmv1a（g983d）未引起nac2降解（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7f–i）。
瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明，是cmv1a而非cmv1a（g983d）抑制nac2介導(dǎo)的samt1激活啟動(dòng)子（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7j）。此外，cmv1a（g983d）或cmv1a植株與wt植株的y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定和gc-ms分析表明，cmv1a（g983d）降低cmv1a介導(dǎo)的植物對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力和抑制mesa揮發(fā)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7k-m）。而且y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定提供了額外的證據(jù)，證實(shí)氨基酸殘基gly983對(duì)cmv1a抑制植株間ad至關(guān)重要。
綜上所述，表明cmv1a通過(guò)與nac2的直接相互作用，影響n(yōu)ac2的亞細(xì)胞定位并破壞其穩(wěn)定性，從而降低轉(zhuǎn)錄因子nac2驅(qū)動(dòng)的samt1激活和mesa的產(chǎn)生，進(jìn)而干擾和抑制ad。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7 圖46. 一些蚜蟲(chóng)傳播的病毒抑制ad
cmv1a具有甲基轉(zhuǎn)移酶和解旋酶活性，并構(gòu)成病毒復(fù)制酶復(fù)合物的一部分，通過(guò)其hd與nac2相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a-d）。值得注意的是，來(lái)自許多蚜蟲(chóng)傳播病毒的hds，包括馬鈴薯y病毒、黃蜂病毒、黃體病毒和阿爾法莫病毒在與cmv1a gly983相對(duì)應(yīng)的位置均含有保守的甘氨酸殘基（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8和9a）。
gc-ms分析顯示，pvy感染并影響了蚜蟲(chóng)侵染后植物mesa的揮發(fā)。此外，作者還研究了，兩種蚜蟲(chóng)傳播的病毒cmv和pvy使nac2能夠從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)重新定位（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9i）。同樣，pvy ci，而不是ci（g347d）或非蚜蟲(chóng)傳播病毒tmv的126kd蛋白，與nac2相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9j，k），并部分破壞nac2的穩(wěn)定性（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9l）。這些結(jié)果表明，一些蚜蟲(chóng)傳播的病毒已經(jīng)進(jìn)化到利用含hd的蛋白質(zhì)作為干擾植物ad的一般策略。 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9
結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)蚜蟲(chóng)侵染植物后，植物會(huì)產(chǎn)生mesa，誘導(dǎo)植物的抗蚜蟲(chóng)免疫，并降低病毒的傳播。此外，還發(fā)現(xiàn)一些蚜蟲(chóng)傳播病毒能夠編碼含有解旋酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與nac2蛋白相互作用，改變nac2蛋白的亞細(xì)胞核定位至細(xì)胞質(zhì)中，促使nac2在細(xì)胞質(zhì)中被26s蛋白酶體降解，從而負(fù)調(diào)控nac2-samt1通路，抑制蚜蟲(chóng)侵染植物mesa的合成和揮發(fā)，阻斷植物間“預(yù)警通訊，促進(jìn)蚜蟲(chóng)對(duì)鄰近植物的侵染和對(duì)病毒的傳播。本研究也鑒定了識(shí)別和感知空氣中mesa的氣味結(jié)合蛋白（obp）樣受體sabp2，揭示了mesa介導(dǎo)植物氣傳性免疫的分子機(jī)制及植物病毒的反防御機(jī)制，說(shuō)明了一種全新的蚜蟲(chóng)-病毒之間共進(jìn)化的共生關(guān)系，為voc觸發(fā)ppc的詳細(xì)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為未來(lái)植物與環(huán)境的適應(yīng)性研究提供了方向。索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)更多產(chǎn)品
套裝貨號(hào)
套裝名稱(chēng)
描述
ia1310
腺苷-5'-三磷酸
是體內(nèi)能量?jī)?chǔ)存和代謝的重要物質(zhì)，為代謝提供能量，同時(shí)在細(xì)胞中作為輔酶發(fā)揮作用。
ia0590
三磷酸腺苷二鈉
是用于代謝反應(yīng)中底物活化的磷酸基團(tuán)供體和大量激酶的輔酶。
ia2970
腺苷-5'-
單磷酸一水
是腺苷a1受體(adenosine a1 receptor)激動(dòng)劑。
ib0100
6-芐氨基喋呤
(6-ba)
是一種細(xì)胞分裂素，通過(guò)刺激細(xì)胞分裂引起植物生長(zhǎng)和發(fā)育，可調(diào)節(jié)植物的抗氧化系統(tǒng)的活性。
ie0110
24-
表油菜素內(nèi)酯
是一種植物生長(zhǎng)激素。據(jù)報(bào)道，具有緩解植物重金屬和農(nóng)藥脅迫潛力。此外，在各種癌細(xì)胞中是一種潛在的凋亡誘導(dǎo)劑，而不影響非腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
ih0650
28-
高油菜素內(nèi)酯
是一種具有生物活性的化合物。
ih0660
28-
表高油菜素內(nèi)酯
具有高促生長(zhǎng)和抗應(yīng)激活性的一類(lèi)新型甾體植物激素。
in0540
1-萘乙酸(naa)
是具有生長(zhǎng)素活性的合成植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
ii0430
3-吲哚乙酸
是一種植物生長(zhǎng)激素。可以添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中用來(lái)誘導(dǎo)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂。
ii0500
吲哚丁酸
是植物生長(zhǎng)素和良好的生根劑。它可以促進(jìn)草本植物和木本觀賞植物生根，并用于提高果實(shí)率。
ii0540
吲哚丙酸
是一種有效的神經(jīng)保護(hù)性抗氧化劑和植物生長(zhǎng)素。
ii0580
吲哚乙腈
是一種植物生長(zhǎng)激素。
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蚜蟲(chóng)是具破壞性的農(nóng)業(yè)和園藝害蟲(chóng)，以韌皮部為食，超過(guò)40%的植物病毒依靠蚜蟲(chóng)傳播來(lái)感染植物，因此對(duì)作物生產(chǎn)造成了大規(guī)模的破壞。蚜蟲(chóng)侵害會(huì)誘導(dǎo)植物釋放包含水楊酸甲酯（mesa）、水楊酸結(jié)合蛋白-2（sabp2）、轉(zhuǎn)錄因子nac2和水楊酸-羧甲基轉(zhuǎn)移酶-1（samt1）在內(nèi)的vocs。mesa在植物防御蚜蟲(chóng)等草食性昆蟲(chóng)侵害中發(fā)揮重要作用，包括驅(qū)除昆蟲(chóng)、吸引捕食者或降低昆蟲(chóng)的生存適應(yīng)性等方式。mesa被認(rèn)為是植物內(nèi)部和長(zhǎng)距離移動(dòng)信號(hào)，參與誘導(dǎo)對(duì)微生物病原體和食草昆蟲(chóng)的系統(tǒng)獲得性抗性（sar）。在sar過(guò)程中，水楊酸（sa）在病原體感染的細(xì)胞中積累，并通過(guò)samt1轉(zhuǎn)化為mesa；然后，mesa通過(guò)韌皮部進(jìn)入遠(yuǎn)端組織，隨后在未侵染葉中被sabp2重新轉(zhuǎn)化為sa。雖然已知mesa作為植物內(nèi)sar信號(hào)的功能，但mesa如何作為植物間通訊的信號(hào)激活ad抗蚜蟲(chóng)防御是一個(gè)長(zhǎng)期未解決的問(wèn)題。植物是否擁有識(shí)別和感知空氣中mesa的受體也不清楚。此外，蚜蟲(chóng)和病毒能否干擾植物氣傳性免疫也未知。本研究揭示了ad的分子機(jī)制和蚜蟲(chóng)-病毒共同進(jìn)化的共生關(guān)系，證明ad是控制蚜蟲(chóng)和病毒的潛在仿生策略。
基本信息
題目：molecular basis of methyl-salicylatemediated plant airborne defence
期刊：
nature
影響因子：64.8
通訊作者：
劉玉樂(lè)
作者單位：
清華大學(xué)等
索萊寶合作產(chǎn)品：
產(chǎn)品貨號(hào)
產(chǎn)品名稱(chēng)
ib0100
6-芐氨基喋呤（6-ba）
ia1310
腺苷-5'-三磷酸
n8010
α-萘乙酸（naa）
摘要蚜蟲(chóng)是具破壞性的作物害蟲(chóng)之一，被蚜蟲(chóng)侵害的植物會(huì)釋放揮發(fā)性化合物，以引起鄰近植物的氣傳性免疫（ad）。本文揭示了mesa、sabp2、轉(zhuǎn)錄因子nac2和samt1形成了信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)鄰近植物針對(duì)蚜蟲(chóng)和病毒的ad。空氣中mesa能夠被mesa受體蛋白水楊酸結(jié)合蛋白-2（sa-binding protein-2，sabp2）感知并轉(zhuǎn)化為水楊酸（salicylic acid, sa）。水楊酸引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，sa激活轉(zhuǎn)錄因子nac2，上調(diào)水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶1（sa-carboxylmethyltransferase-1，samt1）基因的表達(dá)，激活nac2-samt1模塊從而產(chǎn)生更多的mesa，誘導(dǎo)植物的抗蚜蟲(chóng)免疫，從而降低病毒的傳播。一些蚜蟲(chóng)傳播病毒比如黃瓜花葉病毒、馬鈴薯y病毒等能夠編碼含有解旋酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，通過(guò)與nac2蛋白相互作用來(lái)抑制ad，改變nac2蛋白的亞細(xì)胞定位，促進(jìn)nac2在細(xì)胞質(zhì)中被26s蛋白酶體降解，從而負(fù)調(diào)控nac2-samt1通路，抑制mesa的合成和揮發(fā)，阻斷植物間“預(yù)警通訊，促進(jìn)蚜蟲(chóng)對(duì)鄰近植物的侵染和對(duì)病毒的傳播。本研究揭示了ad的分子機(jī)制和蚜蟲(chóng)-病毒共同進(jìn)化的共生關(guān)系，表明ad是一種潛在的生物仿生策略，可以控制蚜蟲(chóng)和病毒的傳播。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
1. 驗(yàn)證植物抗病毒防御需要nac2作者通過(guò)免疫沉淀-質(zhì)譜分析策略（ip-ms），成功鑒定了本氏豬籠草中黃瓜花葉病毒（cmv）的病毒發(fā)病機(jī)制過(guò)程中，核心蛋白cmv1a的相互作用蛋白組，并確定nac2為cmv1a的重要相互作用因子，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a）。cmv1a-nac2相互作用通過(guò)免疫共沉淀（co-ip）、雙分子熒光（bifc）和熒光素酶互補(bǔ)成像（lci）試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1b-d）。為了評(píng)估nac2是否影響cmv對(duì)nac2.1/nac2.2雙敲除（ko）突變株的感染，通過(guò)比較crispr-cas9基因編輯（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a）產(chǎn)生的突變株（nac2植株）和野生型（wt株）的感染結(jié)果，發(fā)現(xiàn)cmv感染導(dǎo)致nac2突變株的癥狀更嚴(yán)重，病毒rna和外殼蛋白（cp）的量更高（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1e-g）。用gfp標(biāo)記的馬鈴薯病毒y或gfp標(biāo)記的tmv（tmv-gfp）感染的突變株和野生型植株中也有類(lèi)似的結(jié)果（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1h-m）。這些數(shù)據(jù)表明，nac2對(duì)植物抗病毒防御至關(guān)重要。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1
2. 證明nac2通過(guò)mesa介導(dǎo)ad對(duì)抗蚜蟲(chóng)
作者在研究中注意到，在nac2葉子上定植的綠桃蚜蟲(chóng)數(shù)量比在wt葉子上的數(shù)量多得多，進(jìn)一步研究了nac2植株對(duì)蚜蟲(chóng)吸引力的作用。作者進(jìn)行了圓形培養(yǎng)皿和y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)nac2植株比wt植株吸引了更多的蚜蟲(chóng)，推測(cè)這可能是由空氣傳播信號(hào)介導(dǎo)的（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1n-o）。作者使用氣相色譜法與ms（gc-ms）相結(jié)合來(lái)鑒定蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株與nac2植株釋放的揮發(fā)物。而mesa是蚜蟲(chóng)侵襲wt植株與nac2植株產(chǎn)生差異的voc，并且蚜蟲(chóng)侵染后wt釋放的mesa多于nac2植株（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2e-h）。mesa是有據(jù)可查的可誘發(fā)蚜蟲(chóng)的voc10-13主要揮發(fā)物。為了測(cè)試nac2植株對(duì)蚜蟲(chóng)吸引力的影響是否歸因于mesa的揮發(fā)，研究人員使用gc-ms測(cè)量了對(duì)蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株在空氣中mesa的排放率，發(fā)現(xiàn)每個(gè)蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株mesa的排放率為34ng h?1（相當(dāng)于每天排放0.816µg）（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2f）。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，含有0.8µg mesa/羊毛脂處理的植株與蚜蟲(chóng)侵襲的wt植株有相似的mesa排放（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2i，j）。因此，研究人員使用0.8µg mesa/羊毛脂涂抹對(duì)植株進(jìn)行處理，結(jié)果表明nac2和wt植株對(duì)蚜蟲(chóng)表現(xiàn)出相似的吸引力（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1p，q）。然而，當(dāng)單獨(dú)用羊毛脂或羊毛脂與其他揮發(fā)物（如3,3-二甲基己烷）處理時(shí)，nac2植株比wt植株對(duì)蚜蟲(chóng)更具吸引力（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1r，s）。研究人員將nac2和wt植株置于揮發(fā)性mesa下24 h，然后通風(fēng)2h，并比較了氣態(tài)mesa如何影響植株對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力。在這樣的條件下，wt植株對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避性更強(qiáng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1t，u）。然而，在通風(fēng)和不進(jìn)行揮發(fā)性mesa處理后，nac2植株之間的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性沒(méi)有明顯差異（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1v，w）。此外，與未進(jìn)行mesa處理時(shí)觀察到的情況一樣，在mesa處理下，與揮發(fā)性mesa處理隨后通風(fēng)的wt植株相比，nac2植株對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力仍然更大（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 1x，y）。
為了解釋這種現(xiàn)象背后的原因（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1t-y），研究人員用揮發(fā)性mesa處理nac2或wt植株24 h，然后通風(fēng)，量化接收植株（接收器）排放的揮發(fā)性mesa。wt植株反而在空氣中釋放出更高水平的mesa（圖1a，b）。隨后研究人員比較了蚜蟲(chóng)mesa接收植株與模擬wt植株在涂抹后的吸引力，所有植株都含有mesa/羊毛脂，但發(fā)現(xiàn)它們?cè)谘料x(chóng)偏好方面沒(méi)有差異（圖1c，d）。此外，在用mesa/羊毛脂涂抹nac2和wt接收植株后，這些mesa接收植株還同樣吸引蚜蟲(chóng)（圖1e，f）。接下來(lái)，研究人員以蚜蟲(chóng)侵襲的植物為發(fā)射植株（發(fā)生源），研究了nac2植株在自然露天環(huán)境下ad的作用（圖3a）。在被吸汁蚜蟲(chóng)感染后，wt植株不斷排放voc mesa（圖1g，h）。值得注意的是，nac2接收植株釋放的mesa波動(dòng)性較低，但是當(dāng)發(fā)生源受到蚜蟲(chóng)攻擊時(shí)，與wt接收植株相比，其表現(xiàn)出對(duì)蚜蟲(chóng)更高的吸引力（圖1i-l）。與鄰近的模擬發(fā)射植株相比，受蚜蟲(chóng)侵染的wt相鄰接收植株對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避性更強(qiáng)，而與模擬蚜蟲(chóng)攻擊發(fā)射植株相鄰的nac2接收植株之間的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性沒(méi)有顯著差異（圖1m，n）。此外，在以接收植株喂食24小時(shí)后，wt中的蚜蟲(chóng)存活率降低，但nac2接收植株的存活率沒(méi)有降低（圖 1o，p）。這些結(jié)果表明，一旦感知到mesa，鄰近接收植株中的mesa生物合成是以nac2依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)進(jìn)而介導(dǎo)可對(duì)抗蚜蟲(chóng)的ad。 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2 圖1
3.nac2激活samt1轉(zhuǎn)錄
接下來(lái)，研究人員開(kāi)始探索nac2和mesa生物合成之間的分子遺傳機(jī)制。nac2作為轉(zhuǎn)錄因子（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b），可以定位于細(xì)胞核中（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c）。隨后，研究人員對(duì)有和沒(méi)有蚜蟲(chóng)喂食的wt和nac2植株進(jìn)行了rna測(cè)序（rna-seq）和比較轉(zhuǎn)錄組分析，并鑒定了許多潛在的nac2調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4和補(bǔ)充表1和2），其中samt1的結(jié)果特別令人感興趣（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4e）。無(wú)論這些植物是否受到蚜蟲(chóng)的侵襲，nac2植株的samt1 rna水平都低于wt植株（補(bǔ)充表1和2）。samt1將sa轉(zhuǎn)化為mesa19，研究人員通過(guò)定量研究nac2、ha-nac2過(guò)表達(dá)和wt植株葉片組織中的samt1轉(zhuǎn)錄本，以評(píng)估nac2是否通過(guò)調(diào)節(jié)samt1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明，與wt植株相比，nac2植株的samt1 mrna水平顯著降低，但ha-nac2過(guò)表達(dá)植株的samt1 mrna水平升高（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3d，e）。此外，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，nac2增強(qiáng)了samt1啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3f）。chip–qpcr、酵母單雜交和emsa分析均表明，nac2與samt1啟動(dòng)子結(jié)合，并激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3g-i）。此外，nac2的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)增加了植物mesa的產(chǎn)生（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 3j）。這些結(jié)果表明，nac2-samt1模塊與植物mesa生物合成的調(diào)控有關(guān)。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4
4. sa激活nac2-samt1模塊引發(fā)ad
為了研究nac2是否通過(guò)激活samt1轉(zhuǎn)錄影響接收植株mesa的產(chǎn)生，研究人員評(píng)估了不同處理?xiàng)l件下突變株nac2、nahg和wt植株中的nac2和samt1的mrna水平（圖 2f）。蚜蟲(chóng)侵襲后，wt和nac2植株的sa水平升高程度相近，然而，細(xì)胞mesa和samt表達(dá)的增加僅在wt植株中發(fā)現(xiàn)（圖2e-g）。在wt接收植株和nac2接收植株鄰近蚜蟲(chóng)侵襲植株中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果（圖 2h-j）。這些結(jié)果表明，nac2是蚜蟲(chóng)定向誘導(dǎo)或蚜蟲(chóng)介導(dǎo)的samt1表達(dá)和揮發(fā)性mesa產(chǎn)生所必需的。此外，外源性sa上調(diào)了nac2和samt1在wt植株中的表達(dá)，但在nac2突變株中samt1 mrna的表達(dá)水平未顯著改變（圖 2k，l）。與nac2突變株相比，外源性sa也誘導(dǎo)wt植株的mesa揮發(fā)性和蚜蟲(chóng)驅(qū)避性（圖2m–p），并增加samt1-ko植株中nac2和samt1轉(zhuǎn)錄本的水平（圖 2q；圖2b，c），samt1植株對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力也更強(qiáng)，而且在samt1植株中外源性sa不誘導(dǎo)蚜蟲(chóng)驅(qū)避（圖2r-t）。此外，暴露于蚜蟲(chóng)侵襲的samt1植株中揮發(fā)性mesa的產(chǎn)生減少（圖3a，b），在進(jìn)一步的蚜蟲(chóng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)與鄰近模擬的wt接收植株相比，鄰近蚜蟲(chóng)侵襲的wt發(fā)射植株的wt接收植株對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避性更強(qiáng)，然而，無(wú)論何時(shí)將這些發(fā)射植株暴露于蚜蟲(chóng)侵襲中，與nac2或samt1發(fā)射植株相鄰的wt接收植株在蚜蟲(chóng)驅(qū)避性方面都沒(méi)有顯著差異（圖3c-e）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了mesa作為植物ad中ppc信號(hào)的作用。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明sa可以激活nac2-samt1轉(zhuǎn)錄進(jìn)而增加發(fā)射和接收植株中揮發(fā)性mesa的產(chǎn)生。
作為一種sa結(jié)合蛋白，sabp2也可以與mesa結(jié)合，這對(duì)于細(xì)胞內(nèi)mesa轉(zhuǎn)化為sa至關(guān)重要。因此，sabp2可以作為一種obp樣受體，感知并將發(fā)射植株產(chǎn)生的揮發(fā)狀態(tài)mesa轉(zhuǎn)化為sa以觸發(fā)nac2介導(dǎo)的接收植株中的蚜蟲(chóng)抗性。為了驗(yàn)證這一想法，研究人員首先確認(rèn)sabp2與sa結(jié)合（圖3f），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mesa是否影響sabp2-sa的結(jié)合活性（圖3g）。在無(wú)mesa的情況下，sabp2-[3h]sa（50 ci mmol?1）結(jié)合力為100%。然而，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，3nm和15nm的mesa，sabp2對(duì)[3h]sa的結(jié)合活性分別降低到約74%和46%（圖3g）。因此，3nm的mesa足以滿(mǎn)足用于[3h]sa與sabp2的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，表明mesa可以以生理濃度與sabp2結(jié)合。隨后，研究人員建立了sabp2-ko突變株（sabp2），并測(cè)試了sabp2突變株與wt植株的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性，用揮發(fā)性的mesa處理，然后進(jìn)行通氣，揮發(fā)性的mesa處理可增加wt的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性和sa生物合成，但對(duì)于sabp2突變株并沒(méi)有增加（圖3h-j和擴(kuò)展圖2d）。此外，蚜蟲(chóng)喂食wt發(fā)射植株增加了wt植株的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性，但sabp2未增加（圖3k）。此外，外源性的sa對(duì)wt和sabp2植株的mesa揮發(fā)性無(wú)顯著差異，表明sabp2對(duì)mesa的釋放不是必須的（圖3l，m）。這些結(jié)果表明，sabp2確實(shí)是一種obp樣受體，可以感知并將空氣中的mesa轉(zhuǎn)化為sa，引起nac2介導(dǎo)的蚜蟲(chóng)驅(qū)避性。
samt1是植物抗病毒免疫所必需的。為了測(cè)試samt1是否為nac2介導(dǎo)的植物抗病毒免疫中的一個(gè)組成部分。研究人員敲低（kd）samt1植株中的nac2，使用基于煙草脆裂病毒（trv）誘導(dǎo)的基因沉默產(chǎn)生nac2/samt1雙突變植株。與nac2突變株一樣，nac2-kd植株表現(xiàn)出正常生長(zhǎng)，和對(duì)cmv和pvy的高易感性（圖1e-j，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a-e，h-l），表明病毒誘導(dǎo)的基因沉默nac2-kd與nac2-ko株有相似性。然而，nac2/samt1和samt1植株表現(xiàn)出相似程度的cmv或pvy易感性（圖 5a-e，h-l）。此外，cmv感染增強(qiáng)了植物細(xì)胞內(nèi)mesa水平（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5f）。在病毒感染期間，nac2-kd、samt1和nac2/samt1植株的未侵襲葉片產(chǎn)生相似數(shù)量的mesa，但與wt植株相比，數(shù)量較低（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5g）。此外，作者還研究了外源性mesa或sa在nac2、sabp2、samt1和wt不同植株中，mesa是否以及如何通過(guò)nac2介導(dǎo)植物抗病毒防御。與wt植株相比，nac2、samt1和sabp2植株對(duì)cmv和pvy更易感（圖3n，o）。然而，外源性mesa可以降低nac2和samt1植株的病毒易感性，但對(duì)sabp2植株無(wú)效（圖 3n，o），可能是由于wt、nac2和samt1植株中的mesa轉(zhuǎn)化為 sa。外噴sa也可以降低nac2、samt1和sabp2植株的病毒易感性（圖3n，o）。這與以下事實(shí)一致：sa可以抑制多種病毒對(duì)植物的感染，包括cmv、馬鈴薯病毒x和tmv。
綜上所述，mesa結(jié)合蛋白sabp2能夠在結(jié)合mesa時(shí)，將細(xì)胞間的mesa轉(zhuǎn)化成sa。由此實(shí)現(xiàn)信號(hào)的發(fā)起。隨后sa激活nac2-samt1模塊，以此上調(diào)內(nèi)源mesa水平，促進(jìn)nac2依賴(lài)性samt1的轉(zhuǎn)錄與翻譯。
圖2 圖3 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖55. cmv1a破壞nac2的穩(wěn)定性以抑制ad
研究表明cmv感染可以抑制蚜蟲(chóng)誘導(dǎo)的ad（圖4a），從而有利于蚜蟲(chóng)的生存和病毒的傳播與感染，可能是通過(guò)cmv介導(dǎo)mesa所致。cmv1a-nac2相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a-d）表明cmv1a可能參與cmv介導(dǎo)的ad抑制。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，首先生成了表達(dá)cmv1a的轉(zhuǎn)基因煙草植物（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a，b），并評(píng)估了cmv1a對(duì)植物、蚜蟲(chóng)和ad吸引力的影響。圓形培養(yǎng)皿和y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定表明，cmv1a表達(dá)導(dǎo)致植物對(duì)蚜蟲(chóng)具有更高的吸引力（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 6c，d）。表明cmv1a參與cmv介導(dǎo)的ad抑制。
為了了解 cmv1a-nac2相互作用在cmv介導(dǎo)的ad抑制中的重要性，研究人員鑒定了cmv1a中與nac2相互作用的關(guān)鍵氨基酸。cmv1a由n端甲基轉(zhuǎn)移酶和c端atp依賴(lài)性解旋酶結(jié)構(gòu)域（hd）組成。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)cmv1a hd是cmv1a-nac2相互作用的主要區(qū)域（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6l）。隨后，研究人員使用alpha fold-multimer27模擬了cmv1a-nac2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并觀察到 cmv1a中983位的甘氨酸殘基與nac2物理距離最近，預(yù)測(cè)該殘基可能是cmv1a與nac2相互作用所必需的（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6m，n）。cmv1a hd或全長(zhǎng)cmv1a中的g983d突變嚴(yán)重降低了cmv1a-nac2的相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 6o-q）。
接下來(lái)，研究人員使用bifc研究了cmv1a-nac2相互作用的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)cmv1a在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都與nac2相互作用（圖1c），這與沒(méi)有cmv1a共表達(dá)的nac2定位不同（圖3c），表明cmv1a可以將一些nac2從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。類(lèi)似的還有cmv1a–myc，但是cluc–myc和cmv1a（g983d）-myc均未出現(xiàn)這種現(xiàn)象，這或許可以解釋引起部分rfp-nac2的細(xì)胞質(zhì)定位和細(xì)胞核中較少的rfp熒光（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 7a）。值得注意的是，cmv1a-myc沒(méi)有改變r(jià)fp核定位，表明cmv1a-myc定向nac2的重新定位取決于nac2-cmv1a相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7b）。此外，研究人員使用核輸出信號(hào)（nes）標(biāo)記的nac2研究了細(xì)胞質(zhì)nac2的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)nes-nac2定位于細(xì)胞質(zhì)中，nac2易被26s-蛋白酶體系統(tǒng)降解（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7c，d）。此外，瞬時(shí)cmv1a表達(dá)增強(qiáng)了26s-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)nac2的降解，但不影響rfp穩(wěn)定性（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 7e-i），而cmv1a（g983d）未引起nac2降解（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7f–i）。
瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明，是cmv1a而非cmv1a（g983d）抑制nac2介導(dǎo)的samt1激活啟動(dòng)子（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7j）。此外，cmv1a（g983d）或cmv1a植株與wt植株的y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定和gc-ms分析表明，cmv1a（g983d）降低cmv1a介導(dǎo)的植物對(duì)蚜蟲(chóng)的吸引力和抑制mesa揮發(fā)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7k-m）。而且y管嗅覺(jué)儀生物測(cè)定提供了額外的證據(jù)，證實(shí)氨基酸殘基gly983對(duì)cmv1a抑制植株間ad至關(guān)重要。
綜上所述，表明cmv1a通過(guò)與nac2的直接相互作用，影響n(yōu)ac2的亞細(xì)胞定位并破壞其穩(wěn)定性，從而降低轉(zhuǎn)錄因子nac2驅(qū)動(dòng)的samt1激活和mesa的產(chǎn)生，進(jìn)而干擾和抑制ad。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7 圖46. 一些蚜蟲(chóng)傳播的病毒抑制ad
cmv1a具有甲基轉(zhuǎn)移酶和解旋酶活性，并構(gòu)成病毒復(fù)制酶復(fù)合物的一部分，通過(guò)其hd與nac2相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a-d）。值得注意的是，來(lái)自許多蚜蟲(chóng)傳播病毒的hds，包括馬鈴薯y病毒、黃蜂病毒、黃體病毒和阿爾法莫病毒在與cmv1a gly983相對(duì)應(yīng)的位置均含有保守的甘氨酸殘基（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8和9a）。
gc-ms分析顯示，pvy感染并影響了蚜蟲(chóng)侵染后植物mesa的揮發(fā)。此外，作者還研究了，兩種蚜蟲(chóng)傳播的病毒cmv和pvy使nac2能夠從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)重新定位（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9i）。同樣，pvy ci，而不是ci（g347d）或非蚜蟲(chóng)傳播病毒tmv的126kd蛋白，與nac2相互作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9j，k），并部分破壞nac2的穩(wěn)定性（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9l）。這些結(jié)果表明，一些蚜蟲(chóng)傳播的病毒已經(jīng)進(jìn)化到利用含hd的蛋白質(zhì)作為干擾植物ad的一般策略。 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8 擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9
結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)蚜蟲(chóng)侵染植物后，植物會(huì)產(chǎn)生mesa，誘導(dǎo)植物的抗蚜蟲(chóng)免疫，并降低病毒的傳播。此外，還發(fā)現(xiàn)一些蚜蟲(chóng)傳播病毒能夠編碼含有解旋酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與nac2蛋白相互作用，改變nac2蛋白的亞細(xì)胞核定位至細(xì)胞質(zhì)中，促使nac2在細(xì)胞質(zhì)中被26s蛋白酶體降解，從而負(fù)調(diào)控nac2-samt1通路，抑制蚜蟲(chóng)侵染植物mesa的合成和揮發(fā)，阻斷植物間“預(yù)警通訊，促進(jìn)蚜蟲(chóng)對(duì)鄰近植物的侵染和對(duì)病毒的傳播。本研究也鑒定了識(shí)別和感知空氣中mesa的氣味結(jié)合蛋白（obp）樣受體sabp2，揭示了mesa介導(dǎo)植物氣傳性免疫的分子機(jī)制及植物病毒的反防御機(jī)制，說(shuō)明了一種全新的蚜蟲(chóng)-病毒之間共進(jìn)化的共生關(guān)系，為voc觸發(fā)ppc的詳細(xì)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為未來(lái)植物與環(huán)境的適應(yīng)性研究提供了方向。索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)更多產(chǎn)品
套裝貨號(hào)
套裝名稱(chēng)
描述
ia1310
腺苷-5'-三磷酸
是體內(nèi)能量?jī)?chǔ)存和代謝的重要物質(zhì)，為代謝提供能量，同時(shí)在細(xì)胞中作為輔酶發(fā)揮作用。
ia0590
三磷酸腺苷二鈉
是用于代謝反應(yīng)中底物活化的磷酸基團(tuán)供體和大量激酶的輔酶。
ia2970
腺苷-5'-
單磷酸一水
是腺苷a1受體(adenosine a1 receptor)激動(dòng)劑。
ib0100
6-芐氨基喋呤
(6-ba)
是一種細(xì)胞分裂素，通過(guò)刺激細(xì)胞分裂引起植物生長(zhǎng)和發(fā)育，可調(diào)節(jié)植物的抗氧化系統(tǒng)的活性。
ie0110
24-
表油菜素內(nèi)酯
是一種植物生長(zhǎng)激素。據(jù)報(bào)道，具有緩解植物重金屬和農(nóng)藥脅迫潛力。此外，在各種癌細(xì)胞中是一種潛在的凋亡誘導(dǎo)劑，而不影響非腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
ih0650
28-
高油菜素內(nèi)酯
是一種具有生物活性的化合物。
ih0660
28-
表高油菜素內(nèi)酯
具有高促生長(zhǎng)和抗應(yīng)激活性的一類(lèi)新型甾體植物激素。
in0540
1-萘乙酸(naa)
是具有生長(zhǎng)素活性的合成植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
ii0430
3-吲哚乙酸
是一種植物生長(zhǎng)激素。可以添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中用來(lái)誘導(dǎo)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂。
ii0500
吲哚丁酸
是植物生長(zhǎng)素和良好的生根劑。它可以促進(jìn)草本植物和木本觀賞植物生根，并用于提高果實(shí)率。
ii0540
吲哚丙酸
是一種有效的神經(jīng)保護(hù)性抗氧化劑和植物生長(zhǎng)素。
ii0580
吲哚乙腈
是一種植物生長(zhǎng)激素。
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