GB 5009.185-2016 食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定
中華人民共和國國家標準
gb 5009.185-2016
食品安全國家標準
食品中展青霉素的測定
前言
本標準代替gb/t 5009.185-2003《蘋果和山楂制品中展青霉素的測定》、ny/t 1650-2008《蘋果及山楂制品中展青霉素的測定高效液相色譜法》、sn/t 2008-2007《進出口果汁中棒曲霉毒素的檢測方法高效液相色譜法》和sn/t 2534-2010《進出口水果和蔬菜制品中展青霉素含量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》和sn/t 1859-2007《飲料中棒曲霉素和5-羥甲基糠醛的測定方法液相色譜-質譜法和氣相色譜-質譜法》中展青霉素部分。
本標準與gb/t 5009.185-2003相比，主要變化如下：
——標準名稱修改為“食品安全國家標準食品中展青霉素的測定”；
——增加了同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法；
——增加了液相色譜法；
——擴大了適用范圍；
——刪除了薄層色譜法。
1范圍
本標準規定了食品中展青霉素的測定方法。
本標準第一法為同位素稀釋-液相色譜串聯質譜法，適用于蘋果和山楂為原料的水果及其制品、果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。
本標準第二法為高效液相色譜法，適用于蘋果為原料的水果及其果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。
第一法同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法
2原理
樣品(濁汁、半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理)中的展青霉素經溶劑提取，展青霉素固相凈化柱或混合型陰離子交換柱凈化、濃縮后，經反相液相色譜柱分離，電噴霧離子源離子化，多反應離子監測檢測，內標法定量。
3試劑和材料
除非另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為gb/t 6682規定的一級水。
3.1試劑
3.1.1乙腈(ch3cn)：色譜純。
3.1.2甲醇(ch3oh)：色譜純。
3.1.3乙酸(ch3cooh)：色譜純。
3.1.4乙酸銨(ch3coonh4)。
3.1.5果膠酶(液體)：活性≥1500u/g，2℃~8℃避光保存。
3.2試劑配制
3.2.1乙酸溶液：取10ml乙酸加入250ml水，混勻。
3.2.2乙酸銨溶液(5mmol/l)：稱取0.38g乙酸銨，加1000ml水溶解。
3.3標準品
3.3.1展青霉素標準品(c7h6o4，cas號：149-29-1)：純度≥99%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。
3.3.213c7-展青霉素同位素內標：25μg/ml，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。
3.4標準溶液配制
3.4.1標準儲備溶液(100μg/ml)：用2ml乙腈溶解展青霉素標準品1.0mg后，移入10ml的容量瓶，乙腈定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20℃下冷凍保存，備用，有效期6個月。展青霉素標準溶液濃度的標定參見附錄a。
3.4.2標準工作液(1μg/ml)：準確吸取100μl經標定過的展青霉素標準儲備溶液至10ml容量瓶中，用乙酸溶液定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在4℃下避光保存，有效期3個月。
3.4.313c7-展青霉素同位素內標工作液(1μg/ml)：準確移取展青霉素同位素內標(25μg/ml)
0.40ml至10ml容量瓶中，用乙酸溶液定容。在4℃下避光保存，備用，3個月內有效。
3.4.4標準系列工作溶液：分別準確移取標準工作液適量至10ml容量瓶中，加入500μl 1.0μg/ml的同位素內標工作液，用乙酸溶液定容至刻度，配制展青霉素濃度為5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml系列標準溶液。
4儀器和設備
4.1液相色譜-質譜聯用儀：帶電噴霧離子源。
4.2勻漿機。
4.3高速粉碎機。
4.4組織搗碎機。
4.5渦旋振蕩器。
4.6 ph計：測量精度±0.02。
4.7天平：感量為0.01g和0.00001g。
4.8 50ml具塞pvc離心管。
4.9離心機：轉速≥6000r/min。
4.10展青霉素固相凈化柱(以下簡稱凈化柱)：混合填料凈化柱mycoseptm228或相當者。
4.11混合型陰離子交換柱：n-乙烯吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基質-ch2n(ch3)2c4h9+為填料的固相萃取柱(6ml，150mg)或相當者。使用前分別用6ml甲醇和6ml水預淋洗并保持柱體濕潤。
4.12 100ml梨形燒瓶。
4.13固相萃取裝置。
4.14旋轉蒸發儀。
4.15氮吹儀。
5分析步驟
5.1試樣制備
5.1.1液體樣品(蘋果汁、山楂汁等)
樣品倒入勻漿機中混勻，取其中任意的100g(或ml)樣品進行檢測。
酒類樣品需超聲脫氣1h或4℃低溫條件下存放過夜脫氣。
5.1.2固體樣品(山楂片、果丹皮等)
樣品用高速粉碎機將其粉碎，混合均勻后取樣品100g用于檢測。果丹皮等高黏度樣品經液氮凍干后立即用高速粉碎機將其粉碎，混合均勻后取樣品100g用于檢測。
5.1.3半流體(蘋果果泥、蘋果果醬、帶果粒果汁等)
樣品在組織搗碎機中搗碎混勻后，取100g用于檢測。
5.2試樣提取及凈化
5.2.1混合型陰離子交換柱法
5.2.1.1試樣提取
5.2.1.1.1澄清果汁
稱取2g試樣(準確至0.01g)，加入50μl同位素內標工作液混勻待凈化。
5.2.1.1.2蘋果酒
稱取1g試樣(準確至0.01g)，加入50μl同位素內標工作液，加水至10ml混勻后待凈化。
5.2.1.1.3固體、半流體試樣
稱取1g試樣(準確至0.01g)于50ml離心管中，加入50μl同位素內標工作液，靜置片刻后，再加入10ml水與75μl果膠酶混勻，室溫下避光放置過夜后，加入10.0ml乙酸乙酯，渦旋混合5min，在6000r/min下離心5min，移取乙酸乙酯層至100ml梨形燒瓶。再用10.0ml乙酸乙酯提取一次，合并兩次乙酸乙酯提取液，在40℃水浴中用旋轉蒸發儀濃縮至干，以5.0ml乙酸溶液溶解殘留物，待凈化處理。
5.2.1.2凈化
將待凈化液轉移至預先活化好的混合型陰離子交換柱中，控制樣液以約3ml/min的速度穩定過柱。上樣完畢后，依次加入3ml的乙酸銨溶液、3ml水淋洗。抽干混合型陰離子交換柱，加入4ml甲醇洗脫，控制流速約3ml/min，收集洗脫液。在洗脫液中加入20μl乙酸，置40℃下用氮氣緩緩吹至近干，用乙酸溶液定容至1.0ml，渦旋30s溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按同一操作方法做空白試驗。
5.2.2凈化柱法
5.2.2.1試樣提取
5.2.2.1.1液體試樣
稱取4g試樣(準確至0.01g)于50ml離心管中，加入250μl同位素內標工作液，加入21ml乙腈，混合均勻，在6000r/min下離心5min，待凈化。
5.2.2.1.2固體、半流體試樣
稱取1g試樣(準確至0.01g)于50ml離心管中，加入100μl同位素內標工作液，混勻后靜置片刻，再加入10ml水與150μl果膠酶溶液混勻，室溫下避光放置過夜后，加入10.0ml乙酸乙酯，渦旋混合5min，在6000r/min下離心5min，移取乙酸乙酯層至梨形燒瓶。再用10.0ml乙酸乙酯提取一次，合并兩次乙酸乙酯提取液，在40℃水浴中用旋轉蒸發儀濃縮至干，以2.0ml乙酸溶液溶解殘留物，再加入8ml乙腈，混勻后待凈化。
5.2.2.2凈化
按照所使用凈化柱的說明書操作，將提取液通過凈化柱凈化，棄去初始的1ml凈化液，收集后續部分。
用吸量管準確吸取5.0ml凈化液，加入20μl乙酸，在40℃下用氮氣緩緩地吹至近干，加入乙酸溶液定容至1ml，渦旋30s溶解殘渣，過0.22μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按同一操作方法做空白試驗。
注：上述方法的樣品提取和凈化部分，包括混合型陰離子交換柱凈化和凈化柱凈化方法，可根據實際情況，選擇其中一種方法即可。
5.3儀器參考條件
5.3.1色譜參考條件
a)色譜柱：t3色譜柱，柱長100mm，內徑2.1mm，粒徑1.8μm，或相當者；
b)流動相：a相：水，b相：乙腈；
c)梯度洗脫條件：5% b(0min~7min)，100% b(7.2min~9min)，5% b(9.2min~13min)；
d)流速：0.3ml/min；
e)色譜柱柱溫：30℃；
f)進樣量：10μl。
5.3.2質譜參考條件
a)檢測方式：多離子反應監測(mrm)；
b)質譜參數及離子選擇參數參見表b.1；
c)子離子掃描圖參見圖b.1和圖b.2；
d)液相色譜-質譜圖見圖b.3。
5.4標準曲線的制作
將標準系列工作溶液由低到高濃度進樣檢測，以標準系列工作溶液中展青霉素的濃度為橫坐標，以展青霉素色譜峰與內標色譜峰的峰面積比值為縱坐標，繪制得到標準曲線。
5.5測定
將試樣溶液注入液相色譜-質譜儀中，測得相應的峰面積，由標準曲線得到試樣溶液中展青霉素的濃度。
5.6定性
試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，變化范圍在±2.5%之內。
每種化合物的質譜定性離子必須出現，至少應包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當的標準溶液相比，其允許偏差不超過表1規定的范圍。
6分析結果的表述
試樣中展青霉素的含量按式(1)計算：
式中：
x——試樣中展青霉素的含量，單位為微克每千克或微克每升(μg/kg或μg/l)；
ρ——由標準曲線計算所得的試樣溶液中展青霉素的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；
v——最終定容體積，單位毫升(ml)；
m——試樣的稱樣量，單位克(g)；
f——稀釋倍數。
計算結果保留三位有效數字。
7精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
8其他
本方法的檢出限和定量限見表2。
第二法高效液相色譜法
9原理
樣品(濁汁、半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理)中的展青霉素經提取，展青霉素固相凈化柱凈化、濃縮后，液相色譜分離，紫外檢測器檢測。外標法定量。
10試劑和材料
除非另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為gb/t 6682規定的一級水。
10.1試劑
10.1.1乙腈(ch3cn)：色譜純。
10.1.2甲醇(ch3oh)：色譜純。
10.1.3乙酸(ch3cooh)：色譜純。
10.1.4乙酸乙酯(ch3cooch2ch3)。
10.1.5乙酸銨(ch3coonh4)。
10.1.6果膠酶(液體)：活性不低于1500u/g，2℃~8℃避光保存。
10.2試劑配制
乙酸溶液：取10ml乙酸加入250ml水，混勻。
10.3標準品
展青霉素標準品(c7h6o4，cas號：149-29-1)：純度≥99%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。
10.4標準溶液配制
10.4.1標準儲備溶液(100μg/ml)：用2ml乙腈溶解展青霉素標準品1.0mg后，移入10ml的容量瓶，乙腈定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20℃下冷凍保存，備用，6個月內有效。展青霉素標準溶液濃度的標定參見附錄a。
10.4.2標準工作液(1μg/ml)：移取100μl經標定過的展青霉素標準儲備溶液，用乙酸溶液溶解并轉移至10ml容量瓶中，定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在4℃下避光保存，3個月內有效。
10.4.3標準系列工作溶液：分別準確移取標準工作液適量至5ml容量瓶中，用乙酸溶液定容至刻度，配制展青霉素濃度為5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml系列標準溶液。
11儀器和設備
11.1液相色譜儀：配紫外檢測器。
11.2勻漿機。
11.3高速粉碎機。
11.4組織搗碎機。
11.5渦旋振蕩器。
11.6 ph計：測量精度±0.02。
11.7天平：感量為0.01g和0.00001g。
11.8 50ml具塞pvc離心管。
11.9離心機：轉速≥6000r/min。
11.10展青霉素固相凈化柱：混合填料凈化柱mycoseptm228或相當者。
11.11 100ml梨形燒瓶。
11.12固相萃取裝置。
11.13旋轉蒸發儀。
11.14氮吹儀。
11.15一次性水相微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜。
12分析步驟
12.1試樣制備
同5.1。
12.2試樣提取及凈化
除不加同位素內標外，試樣提取及凈化柱凈化操作同5.2.2。
12.3儀器參考條件
a)液相色譜柱：t3柱，柱長150mm，內徑4.6mm，粒徑3.0μm，或相當者；
b)流動相：a相：水，b相：乙腈；
c)梯度洗脫條件：5% b(0min~13min)，100% b(13min~15min)，5% b(15min~20min)；
d)流速：0.8ml/min；
e)色譜柱柱溫：40℃；
f)進樣量：100μl；
g)紫外檢測器條件：檢測波長為276nm。
12.4標準曲線的制作
將標準系列溶液由低到高濃度依次進樣檢測，以標準溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。
12.5測定
將試樣溶液注入液相色譜-質譜儀中，測得相應的峰面積，由標準曲線得到試樣溶液中展青霉素的濃度。
13分析結果的表述
試樣中展青霉素的含量按式(2)計算：
式中：
x——試樣中展青霉素的含量，單位為微克每千克或微克每升(μg/kg或μg/l)；
ρ——由標準曲線得到的試樣溶液中展青霉素的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；
v——最終定容體積，單位毫升(ml)；
m——試樣的稱樣量，單位克(g)；
f——稀釋倍數。
計算結果保留三位有效數字。
14精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
15其他
液體試樣的檢出限為6μg/kg，定量限為20μg/kg；固體、半流體試樣的檢出限為12μg/kg，定量限為40μg/kg。
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gb 5009.185-2016
食品安全國家標準
食品中展青霉素的測定
前言
本標準代替gb/t 5009.185-2003《蘋果和山楂制品中展青霉素的測定》、ny/t 1650-2008《蘋果及山楂制品中展青霉素的測定高效液相色譜法》、sn/t 2008-2007《進出口果汁中棒曲霉毒素的檢測方法高效液相色譜法》和sn/t 2534-2010《進出口水果和蔬菜制品中展青霉素含量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法》和sn/t 1859-2007《飲料中棒曲霉素和5-羥甲基糠醛的測定方法液相色譜-質譜法和氣相色譜-質譜法》中展青霉素部分。
本標準與gb/t 5009.185-2003相比，主要變化如下：
——標準名稱修改為“食品安全國家標準食品中展青霉素的測定”；
——增加了同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法；
——增加了液相色譜法；
——擴大了適用范圍；
——刪除了薄層色譜法。
1范圍
本標準規定了食品中展青霉素的測定方法。
本標準第一法為同位素稀釋-液相色譜串聯質譜法，適用于蘋果和山楂為原料的水果及其制品、果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。
本標準第二法為高效液相色譜法，適用于蘋果為原料的水果及其果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。
第一法同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法
2原理
樣品(濁汁、半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理)中的展青霉素經溶劑提取，展青霉素固相凈化柱或混合型陰離子交換柱凈化、濃縮后，經反相液相色譜柱分離，電噴霧離子源離子化，多反應離子監測檢測，內標法定量。
3試劑和材料
除非另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為gb/t 6682規定的一級水。
3.1試劑
3.1.1乙腈(ch3cn)：色譜純。
3.1.2甲醇(ch3oh)：色譜純。
3.1.3乙酸(ch3cooh)：色譜純。
3.1.4乙酸銨(ch3coonh4)。
3.1.5果膠酶(液體)：活性≥1500u/g，2℃~8℃避光保存。
3.2試劑配制
3.2.1乙酸溶液：取10ml乙酸加入250ml水，混勻。
3.2.2乙酸銨溶液(5mmol/l)：稱取0.38g乙酸銨，加1000ml水溶解。
3.3標準品
3.3.1展青霉素標準品(c7h6o4，cas號：149-29-1)：純度≥99%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。
3.3.213c7-展青霉素同位素內標：25μg/ml，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。
3.4標準溶液配制
3.4.1標準儲備溶液(100μg/ml)：用2ml乙腈溶解展青霉素標準品1.0mg后，移入10ml的容量瓶，乙腈定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20℃下冷凍保存，備用，有效期6個月。展青霉素標準溶液濃度的標定參見附錄a。
3.4.2標準工作液(1μg/ml)：準確吸取100μl經標定過的展青霉素標準儲備溶液至10ml容量瓶中，用乙酸溶液定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在4℃下避光保存，有效期3個月。
3.4.313c7-展青霉素同位素內標工作液(1μg/ml)：準確移取展青霉素同位素內標(25μg/ml)
0.40ml至10ml容量瓶中，用乙酸溶液定容。在4℃下避光保存，備用，3個月內有效。
3.4.4標準系列工作溶液：分別準確移取標準工作液適量至10ml容量瓶中，加入500μl 1.0μg/ml的同位素內標工作液，用乙酸溶液定容至刻度，配制展青霉素濃度為5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml系列標準溶液。
4儀器和設備
4.1液相色譜-質譜聯用儀：帶電噴霧離子源。
4.2勻漿機。
4.3高速粉碎機。
4.4組織搗碎機。
4.5渦旋振蕩器。
4.6 ph計：測量精度±0.02。
4.7天平：感量為0.01g和0.00001g。
4.8 50ml具塞pvc離心管。
4.9離心機：轉速≥6000r/min。
4.10展青霉素固相凈化柱(以下簡稱凈化柱)：混合填料凈化柱mycoseptm228或相當者。
4.11混合型陰離子交換柱：n-乙烯吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基質-ch2n(ch3)2c4h9+為填料的固相萃取柱(6ml，150mg)或相當者。使用前分別用6ml甲醇和6ml水預淋洗并保持柱體濕潤。
4.12 100ml梨形燒瓶。
4.13固相萃取裝置。
4.14旋轉蒸發儀。
4.15氮吹儀。
5分析步驟
5.1試樣制備
5.1.1液體樣品(蘋果汁、山楂汁等)
樣品倒入勻漿機中混勻，取其中任意的100g(或ml)樣品進行檢測。
酒類樣品需超聲脫氣1h或4℃低溫條件下存放過夜脫氣。
5.1.2固體樣品(山楂片、果丹皮等)
樣品用高速粉碎機將其粉碎，混合均勻后取樣品100g用于檢測。果丹皮等高黏度樣品經液氮凍干后立即用高速粉碎機將其粉碎，混合均勻后取樣品100g用于檢測。
5.1.3半流體(蘋果果泥、蘋果果醬、帶果粒果汁等)
樣品在組織搗碎機中搗碎混勻后，取100g用于檢測。
5.2試樣提取及凈化
5.2.1混合型陰離子交換柱法
5.2.1.1試樣提取
5.2.1.1.1澄清果汁
稱取2g試樣(準確至0.01g)，加入50μl同位素內標工作液混勻待凈化。
5.2.1.1.2蘋果酒
稱取1g試樣(準確至0.01g)，加入50μl同位素內標工作液，加水至10ml混勻后待凈化。
5.2.1.1.3固體、半流體試樣
稱取1g試樣(準確至0.01g)于50ml離心管中，加入50μl同位素內標工作液，靜置片刻后，再加入10ml水與75μl果膠酶混勻，室溫下避光放置過夜后，加入10.0ml乙酸乙酯，渦旋混合5min，在6000r/min下離心5min，移取乙酸乙酯層至100ml梨形燒瓶。再用10.0ml乙酸乙酯提取一次，合并兩次乙酸乙酯提取液，在40℃水浴中用旋轉蒸發儀濃縮至干，以5.0ml乙酸溶液溶解殘留物，待凈化處理。
5.2.1.2凈化
將待凈化液轉移至預先活化好的混合型陰離子交換柱中，控制樣液以約3ml/min的速度穩定過柱。上樣完畢后，依次加入3ml的乙酸銨溶液、3ml水淋洗。抽干混合型陰離子交換柱，加入4ml甲醇洗脫，控制流速約3ml/min，收集洗脫液。在洗脫液中加入20μl乙酸，置40℃下用氮氣緩緩吹至近干，用乙酸溶液定容至1.0ml，渦旋30s溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按同一操作方法做空白試驗。
5.2.2凈化柱法
5.2.2.1試樣提取
5.2.2.1.1液體試樣
稱取4g試樣(準確至0.01g)于50ml離心管中，加入250μl同位素內標工作液，加入21ml乙腈，混合均勻，在6000r/min下離心5min，待凈化。
5.2.2.1.2固體、半流體試樣
稱取1g試樣(準確至0.01g)于50ml離心管中，加入100μl同位素內標工作液，混勻后靜置片刻，再加入10ml水與150μl果膠酶溶液混勻，室溫下避光放置過夜后，加入10.0ml乙酸乙酯，渦旋混合5min，在6000r/min下離心5min，移取乙酸乙酯層至梨形燒瓶。再用10.0ml乙酸乙酯提取一次，合并兩次乙酸乙酯提取液，在40℃水浴中用旋轉蒸發儀濃縮至干，以2.0ml乙酸溶液溶解殘留物，再加入8ml乙腈，混勻后待凈化。
5.2.2.2凈化
按照所使用凈化柱的說明書操作，將提取液通過凈化柱凈化，棄去初始的1ml凈化液，收集后續部分。
用吸量管準確吸取5.0ml凈化液，加入20μl乙酸，在40℃下用氮氣緩緩地吹至近干，加入乙酸溶液定容至1ml，渦旋30s溶解殘渣，過0.22μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按同一操作方法做空白試驗。
注：上述方法的樣品提取和凈化部分，包括混合型陰離子交換柱凈化和凈化柱凈化方法，可根據實際情況，選擇其中一種方法即可。
5.3儀器參考條件
5.3.1色譜參考條件
a)色譜柱：t3色譜柱，柱長100mm，內徑2.1mm，粒徑1.8μm，或相當者；
b)流動相：a相：水，b相：乙腈；
c)梯度洗脫條件：5% b(0min~7min)，100% b(7.2min~9min)，5% b(9.2min~13min)；
d)流速：0.3ml/min；
e)色譜柱柱溫：30℃；
f)進樣量：10μl。
5.3.2質譜參考條件
a)檢測方式：多離子反應監測(mrm)；
b)質譜參數及離子選擇參數參見表b.1；
c)子離子掃描圖參見圖b.1和圖b.2；
d)液相色譜-質譜圖見圖b.3。
5.4標準曲線的制作
將標準系列工作溶液由低到高濃度進樣檢測，以標準系列工作溶液中展青霉素的濃度為橫坐標，以展青霉素色譜峰與內標色譜峰的峰面積比值為縱坐標，繪制得到標準曲線。
5.5測定
將試樣溶液注入液相色譜-質譜儀中，測得相應的峰面積，由標準曲線得到試樣溶液中展青霉素的濃度。
5.6定性
試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，變化范圍在±2.5%之內。
每種化合物的質譜定性離子必須出現，至少應包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當的標準溶液相比，其允許偏差不超過表1規定的范圍。
6分析結果的表述
試樣中展青霉素的含量按式(1)計算：
式中：
x——試樣中展青霉素的含量，單位為微克每千克或微克每升(μg/kg或μg/l)；
ρ——由標準曲線計算所得的試樣溶液中展青霉素的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；
v——最終定容體積，單位毫升(ml)；
m——試樣的稱樣量，單位克(g)；
f——稀釋倍數。
計算結果保留三位有效數字。
7精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
8其他
本方法的檢出限和定量限見表2。
第二法高效液相色譜法
9原理
樣品(濁汁、半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理)中的展青霉素經提取，展青霉素固相凈化柱凈化、濃縮后，液相色譜分離，紫外檢測器檢測。外標法定量。
10試劑和材料
除非另有說明，本方法使用的試劑均為分析純，水為gb/t 6682規定的一級水。
10.1試劑
10.1.1乙腈(ch3cn)：色譜純。
10.1.2甲醇(ch3oh)：色譜純。
10.1.3乙酸(ch3cooh)：色譜純。
10.1.4乙酸乙酯(ch3cooch2ch3)。
10.1.5乙酸銨(ch3coonh4)。
10.1.6果膠酶(液體)：活性不低于1500u/g，2℃~8℃避光保存。
10.2試劑配制
乙酸溶液：取10ml乙酸加入250ml水，混勻。
10.3標準品
展青霉素標準品(c7h6o4，cas號：149-29-1)：純度≥99%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。
10.4標準溶液配制
10.4.1標準儲備溶液(100μg/ml)：用2ml乙腈溶解展青霉素標準品1.0mg后，移入10ml的容量瓶，乙腈定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20℃下冷凍保存，備用，6個月內有效。展青霉素標準溶液濃度的標定參見附錄a。
10.4.2標準工作液(1μg/ml)：移取100μl經標定過的展青霉素標準儲備溶液，用乙酸溶液溶解并轉移至10ml容量瓶中，定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后，在4℃下避光保存，3個月內有效。
10.4.3標準系列工作溶液：分別準確移取標準工作液適量至5ml容量瓶中，用乙酸溶液定容至刻度，配制展青霉素濃度為5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml系列標準溶液。
11儀器和設備
11.1液相色譜儀：配紫外檢測器。
11.2勻漿機。
11.3高速粉碎機。
11.4組織搗碎機。
11.5渦旋振蕩器。
11.6 ph計：測量精度±0.02。
11.7天平：感量為0.01g和0.00001g。
11.8 50ml具塞pvc離心管。
11.9離心機：轉速≥6000r/min。
11.10展青霉素固相凈化柱：混合填料凈化柱mycoseptm228或相當者。
11.11 100ml梨形燒瓶。
11.12固相萃取裝置。
11.13旋轉蒸發儀。
11.14氮吹儀。
11.15一次性水相微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜。
12分析步驟
12.1試樣制備
同5.1。
12.2試樣提取及凈化
除不加同位素內標外，試樣提取及凈化柱凈化操作同5.2.2。
12.3儀器參考條件
a)液相色譜柱：t3柱，柱長150mm，內徑4.6mm，粒徑3.0μm，或相當者；
b)流動相：a相：水，b相：乙腈；
c)梯度洗脫條件：5% b(0min~13min)，100% b(13min~15min)，5% b(15min~20min)；
d)流速：0.8ml/min；
e)色譜柱柱溫：40℃；
f)進樣量：100μl；
g)紫外檢測器條件：檢測波長為276nm。
12.4標準曲線的制作
將標準系列溶液由低到高濃度依次進樣檢測，以標準溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。
12.5測定
將試樣溶液注入液相色譜-質譜儀中，測得相應的峰面積，由標準曲線得到試樣溶液中展青霉素的濃度。
13分析結果的表述
試樣中展青霉素的含量按式(2)計算：
式中：
x——試樣中展青霉素的含量，單位為微克每千克或微克每升(μg/kg或μg/l)；
ρ——由標準曲線得到的試樣溶液中展青霉素的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；
v——最終定容體積，單位毫升(ml)；
m——試樣的稱樣量，單位克(g)；
f——稀釋倍數。
計算結果保留三位有效數字。
14精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
15其他
液體試樣的檢出限為6μg/kg，定量限為20μg/kg；固體、半流體試樣的檢出限為12μg/kg，定量限為40μg/kg。
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