四正柏凋亡檢測試劑盒說明書
四正柏凋亡檢測試劑盒說明書相關介紹:細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(ps)從細胞膜內轉移到細胞膜外，使ps暴露在細胞膜外表面。ps是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使ps暴露在細胞膜外。annexin v具有易于結合到磷脂類如ps的特性，對ps有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的ps。ps轉移到細胞膜外不是凋亡所獨te的，也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用annexin v與pi雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。
儲存條件:2-8℃避光保存,勿冰凍。
有 效 期：一年
注意事項:本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。此產品僅供研究，不用于臨床診斷。
操作步驟：
細胞樣品的準備：
a)對于貼壁細胞：小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用不含edta的胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完quan離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的pbs，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。
b)對于懸浮細胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完quan離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的pbs，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。
用去離子水按1:3稀釋結合緩沖液(4ml 4x結合緩沖液+12ml去離子水)；
用1x結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為1-5×106/ml；
取100µl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5µl annexin v/fitc混勻后于室溫避光孵育5分鐘；
加入10µl 20ug/ml的碘化丙錠溶液(pi)，并加400µl pbs，立刻進行流式檢測。
實驗設計：
空白管：陰性對照組細胞，不加annexin v/fitc，碘化丙錠溶液(pi)。用于調節電壓單染管：陽性對照組細胞，只加annexin v/fitc。用于調節補償
檢測管：處理的細胞，加 annexin v/fitc，碘化丙錠溶液(pi)。用空白管和單染管調節好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。
樣本分析：
1. 流式細胞儀分析：fitc 的最大激發波長是 488nm，最大發射波長是 525nm，建議選擇fl1 通道檢測；pi-dna復合物的最大激發波長是 535nm，最大發射波長為 615nm，pi 的紅色熒光在 fl2 或 fl3 通道檢測。用flowjo等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），fitc 為橫坐標，pi 為縱坐標。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡或壞死的細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。
2. 熒光顯微鏡觀察：
a)滴一滴用 annexin v-fitc/pi 雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。
b)在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。annexin v-fitc 熒光信號呈綠色，pi 熒光信號呈紅色。
【注】：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。
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應用
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操作步驟：
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a)對于貼壁細胞：小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用不含edta的胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完quan離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的pbs，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。
b)對于懸浮細胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完quan離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的pbs，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。
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樣本分析：
1. 流式細胞儀分析：fitc 的最大激發波長是 488nm，最大發射波長是 525nm，建議選擇fl1 通道檢測；pi-dna復合物的最大激發波長是 535nm，最大發射波長為 615nm，pi 的紅色熒光在 fl2 或 fl3 通道檢測。用flowjo等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），fitc 為橫坐標，pi 為縱坐標。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡或壞死的細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。
2. 熒光顯微鏡觀察：
a)滴一滴用 annexin v-fitc/pi 雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。
b)在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。annexin v-fitc 熒光信號呈綠色，pi 熒光信號呈紅色。
【注】：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。
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