納米抗體制備的免疫細胞收集
免疫細胞免疫細胞包括很多細胞：
先天免疫細胞：粒細胞（嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞），肥大細胞，單核細胞（發展成巨噬細胞），中性粒細胞，樹突狀細胞（dc是一種重要的抗原呈遞細胞（apc），也可以由單核細胞發育而來），自然殺傷細胞(nk具有先天免疫和適應性免疫的雙重特性，可以保留為記憶細胞）。
適應性免疫細胞：b細胞（有兩個主要功能: ① 向t細胞提供抗原，② 產生抗體來中和感染性微生物。）t細胞（有多種作用，并按亞群分類。t細胞分為兩大類: cd8+ t細胞或cd4+ t細胞）。
免疫細胞的收集免疫細胞的收集通常說的是外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, pbmc）的收集。正如名字所指出的，pbmc是指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞（lymphocytes）、單核細胞（monocytes）、樹突狀細胞（dc）和其他少量細胞。
淋巴細胞包括b細胞、t細胞、nk細胞等細胞，占據pbmc細胞的大多數，也并沒有發現很多將兩者分開的文章和操作手冊，因此在此我們只針對pbmc細胞的收集做一個概述。
pbmc存在于外周血中，可利用細胞分離技術從全血中分離出來。總的來說，pbmc只占全血樣本的一小部分（約1%），當被其他物質擠在一起時，很難進行研究。三種較常見的pbmc分離方法包括：密度梯度離心、熒光活化細胞分選（facs）、磁激活細胞分選(macs)，每一種血液分離方法都有自己的優點和缺點。
密度梯度離心密度梯度離心依靠物理特性，如大小和密度來分選細胞群。通過將樣品放入高速旋轉的離心機中，不同類型的細胞將通過與相似密度的顆粒分組來進行分類。密度較大的粒子會落到底部或外面，而密度較小的粒子會停留在中心或上升到頂部。對一個標準的全血樣本進行離心，將分離出血液成分的一般層，集中在試管底部的紅細胞(大約占總體積的45%)，中間層的灰白色涂層層——包含各種白細胞和血小板(大約占總體積的1%)，以及血漿——包含允許血液流動的水狀液體，隨著各種蛋白質和溶解的營養物質和氣體(大約占總體積的55%)在管的頂部。
根據所用采血管含有的成分，密度梯度離心也有三種方法。
檸檬酸鈉cpt管采血的細胞分離
檸檬酸鈉是一種抗凝劑：檸檬酸根可與血液中的鈣離子結合，生成可溶解性的絡合物。由于鈣離子在凝血過程中起到促進凝血作用，因此血液中的鈣離子濃度下降會阻止血液的凝結。
步驟：
1. 室溫(15℃~ 30℃)豎直存放血漿收集管，直到離心。
2. 離心前將試管輕輕倒轉8 - 10次，使細胞重新混合。
3. 將離心管置于水平轉子中，室溫(15℃~30℃)，1800 x g (rcf)離心30分鐘。轉速必須仔細計算。降速過程中不要使用剎車。應注意確保cpt管是正確地安裝在離心機中。
4. 在離心機停止后，小心地取出試管并放置在一個架子上。
5. 單個核細胞和血小板位于血漿層下方的白色層中(見圖1)。
6. 在不干擾細胞層的情況下，從每根cpt管中抽取血漿層。如果方案要求收集血漿，請參閱方案的具體文件。
7. 用移液管從每個試管中收集單個核細胞層，并將其轉移到50ml帶帽的塑料錐形離心管。
8. 如果收集3根或更少(≤3根)cpt管，將全部cpt管收集到的細胞層放入一個50ml離心管。
9. 如果收集的cpt管多于3根(>3)，則取其中2 - 3根cpt管的細胞層放入一個50ml離心管。不要將三個以上cpt管的細胞層組合在一起放入一個50ml離心管。重復此步驟，直到將所有cpt管的細胞層轉移到50ml離心管中，然后進行洗滌步驟。
圖1 cpt管離心結果
帶有預填充 frit 屏障的acd、nahep或edta管采集血液的細胞分離
在加入血液之前，目視檢查cstfb，看是否有液體在 frit上面。如果 frit上面有液體，將cstfb在1000 x g下離心30秒。如果有密度梯度離心后溶液仍在 frit上方，應吸除。
步驟：
1. 血液稀釋用于cstfb分離
血液與生理鹽水的比例約為2:1。每10 ~ 20ml全血使用一個50ml管(或每5 ~ 10ml全血用一個12 ~ 14ml管)。按要求使用盡可能多的cstfb來分配每個樣品的所有血液。
(1) 在每個cstfb上標上樣品識別號。
(2) 用無菌吸管向每個cstfb中加入生理鹽水溶液：50ml cstfb管加5ml生理鹽水。
(3) 輕輕混合全血，然后用無菌移液器將血液轉移到標記的cstfb中。
(4) 使用無菌移液器，用生理鹽水沖洗每個原始抗凝血管并轉移溶液沖洗量到cstfb，確保不超過總管體積(生理鹽水+全血)的限制：50ml管的總體積不應超過30ml。
(5) 小心蓋上cstfb。
2. cstfb密度離心和pbmc收集
(1) 保持試管直立，輕輕轉移到離心機上。
(2) 800 ~ 1000 x g, 15℃~ 30℃離心15分鐘，關閉剎車。(一些樣品在1000g離心pbmc分離的效果可以改善。如果降速過程中存在剎車，就會破壞分層。)
(3) 離心時，準備新無菌離心管；這將與上一步中使用的管子數量相同。用樣品識別號標記每個試管。
(4) 輕輕將cstfb從離心機中取出，以免擾亂各層。
(5) 離心使試管（包括 frit層）的內容物分成六個不同的層。
(6) 檢查管里是否有以下可能的問題。根據實驗室要求記錄觀察結果和采取的后續行動。
①、血漿+生理鹽水溶液層。
②、離心后在 frit上可見凝塊。
③、由于離心速度，時間或制動錯誤，pbmc層較差。pbmc層小而模糊，血漿+生理鹽水層可能略有混濁。
④、由于紅細胞計數或紅細胞比容低，在 frit上形成pbmc層。
(7) 每個樣品使用新的無菌移液管去除上層淡黃色血漿+鹽水溶液的組分，至云狀白色pbmc帶（位于血漿+鹽溶液層界面和透明分離介質溶液間）的上方約1~2厘米的位置。根據實驗室政策，丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色pbmc帶可通過上層小心插入移液器移至pbmc帶。）
(8) 使用無菌血清學移液器收集上述pbmc帶處的所有細胞。注意不要吸入多于必要的分離介質溶液。
(9) 將收集到的細胞從一個cstfb轉移到一個相應的、預標記的無菌離心管。管子可以預先添加鹽水溶液以節省時間（50ml管加25ml生理鹽水溶液）。之后進行洗滌步驟。
(10) 將含有剩余的紅細胞和分離介質cstfb重新蓋上蓋子。按照實驗室政策，將cstfb作為生物危害廢物丟棄。
圖2 pre-filled frit barrier管離心結果
手動密度梯度介質覆蓋或襯底分離細胞 （ficoll分離）
分離單核細胞常使用ficoll作為分離液的主要成分，ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400000，當密度為1.2g/ml時也未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。
通過ficoll密度梯度離心，紅細胞、粒細胞比重大于分離液比重，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分離液，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面上的細胞，就可從外周血中分離到單核細胞，并進行之后的培養與檢測。
步驟：
1. 血液稀釋
(1) 打開抗凝血管的蓋子。
(2) 在每根離心管上標上樣品識別號（50ml管加12 ~ 22ml血，15ml管加4至5ml血）。
(3) 將血液移入無菌、有標記的15或50ml離心管中，根據制備密度梯度的試劑盒說明加入足夠的生理鹽水來稀釋血液（血液與稀釋液的比例應為2:1）。
2. 密度梯度細胞分離
（兩種方法：（1）覆蓋overlay，先制備梯度在加樣品；（2）襯底underlay，先加樣品再加梯度。加完后蓋好蓋子。）
3. 淋巴細胞密度離心和pbmc收集
(1) 保持試管直立，輕輕地轉移到離心機。
(2) 按照說明書概述，在15~30°c條件下，400 x g離心30分鐘，關閉制動器。（如果降速過程中存在制動會破壞分離層。離心機制動器必須關閉以使分離干凈，并回收pbmc。）
(3) 離心使管內內容物分成四層。
圖3 ficoll密度梯度離心結果
(4) 在離心管進行離心時，準備新的無菌離心管。這將與上一步驟中使用的管子數量相同。用樣品識別號標記每個試管。
(5) 離心完成后從離心機上取下離心管。
(6) 如果看不到細胞層，確認離心機運轉正常。糾正你發現的任何問題。重新離心試管。記錄問題和在研究記錄中采取的行動。
①、如果再離心后細胞層仍然不可見，記錄，移除和丟棄鹽溶液上清，然后繼續。
②、如果血漿層非常渾濁，可能很難看到血漿層與密度梯度介質的界面。用10ml移液管除去界面上方的大部分血漿可改善淋巴細胞的收集，例如只留下0.5厘米的血漿層。
(7) 每份樣品使用新的無菌移液器，去除上層黃色血漿+生理鹽水溶液的組分，至渾濁白色pbmc帶的上方大約1~2cm的位置（位于血漿+生理鹽水溶液淡黃色組分和密度梯度分離介質溶液間）。按實驗室政策丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色pbmc帶可通過上層小心插入移液器移至pbmc帶。）
(8) 使用無菌移液管，在pbmc帶（濁白處）收集所有細胞。注意不要吸入更多的分離介質溶液。
(9) 將收集到的細胞從一個錐形離心管轉移到另一個相應的、預標記的無菌離心管。離心管可以預先填充生理鹽水以節省時間。之后進行洗滌。
4. 重新蓋上裝有剩余紅細胞/分離物的錐形離心管。按照實驗室政策，將試管作為生物危害廢物進行培養基和丟棄。
流式細胞術涉及到流式細胞儀的使用的一種免疫細胞分離技術，流式細胞儀是一種根據大小、形狀和熒光亮度等特征標記不同顆粒的儀器。這種方法被稱為熒光激活細胞分選(facs)，它允許樣品流過一個管子，然后將成分分成不同的組。
facs需要昂貴的設備和受過適當訓練的人員。這種技術在分選需要許多不同群體的不同細胞樣本時很有用，但使用這種方法分離白細胞非常耗時。通常，在使用流式細胞術處理之前，樣品應首*行“制備”或清理，以分離原始樣品內容物的特定子集，這可以減少細胞分選所需的時間，因為機器將處理更小、更濃縮的樣品量。這樣還可以產生更多健康的、有活力的細胞，因為當處理時間大大減少時，自然細胞死亡就會減少。
magnetic-activated cell sorting (macs) 磁激活細胞分選另一種方法是將磁珠與靶細胞結合，并使樣品通過磁場，使附著磁鐵的細胞懸浮。磁激活細胞分選(macs)比前面提到的兩種方法更快、更便宜，但它的細胞損失是三種方法中較高的。強烈的磁場會使細胞破裂、細胞器破裂、使樣品混亂。這種細胞外碎片可引起結塊和阻塞，從而導致較低的吞吐量。
隨著科技和技術的不斷進步，相信會有更好的免疫細胞分離技術不斷涌現，我們也會繼續關注相關發展，以便為顧客提供更好的服務。
泰克生物致力于納米抗體領域多年，為很多客戶提供了優質的產品和服務，此外，泰克生物擁有豐富的抗體工程構造經驗，能夠進行立體化的抗體上下游服務，包括抗體人源化服務、人源scfv抗體庫構建服務、人源fab抗體文庫構建服務、人源抗體噬菌體文庫制備服務以及磷酸化抗體定制服務、抗體親和力成熟服務等，滿足不同客戶的科研要求。
水產養殖脫氮專用懸浮填料有助于提高水產養殖系統的環境可持續性
直銷A4鋼高溫合金管材
YDD-450-VS/PM細胞樣本庫液氮生物容器
crf-等離子體表面處理儀催化劑改性方式的分析
徠卡倒置熒光顯微鏡關于組織塊的體積
納米抗體制備的免疫細胞收集
如何提高氣相色譜柱柱效
TMA儀器的校準-Q系列靜態熱機械分析儀
煤礦溫度計
意大利MP FILTRI高壓濾芯技術特點,翡翠過濾器代理
超聲波 傳感器 德國 倍加福 （P+F）
了解一下美國MAMAC SYSTEMS馬麥克溫度傳感器
電子地磅下雨天使用注意事項
超聲波手持式氣象儀簡單介紹
三孔獨立控溫恒溫水箱（三孔恒溫水槽）使用辦法
多功能分子雜交箱技術參數
三豐低測力高度計318-221DC產品簡介
為何鹽霧箱箱蓋角度是106°原因既如此簡單
實驗臺的布置方式
青島離心風機：維護離心風機時注意事項
先天免疫細胞：粒細胞（嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞），肥大細胞，單核細胞（發展成巨噬細胞），中性粒細胞，樹突狀細胞（dc是一種重要的抗原呈遞細胞（apc），也可以由單核細胞發育而來），自然殺傷細胞(nk具有先天免疫和適應性免疫的雙重特性，可以保留為記憶細胞）。
適應性免疫細胞：b細胞（有兩個主要功能: ① 向t細胞提供抗原，② 產生抗體來中和感染性微生物。）t細胞（有多種作用，并按亞群分類。t細胞分為兩大類: cd8+ t細胞或cd4+ t細胞）。
免疫細胞的收集免疫細胞的收集通常說的是外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, pbmc）的收集。正如名字所指出的，pbmc是指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞（lymphocytes）、單核細胞（monocytes）、樹突狀細胞（dc）和其他少量細胞。
淋巴細胞包括b細胞、t細胞、nk細胞等細胞，占據pbmc細胞的大多數，也并沒有發現很多將兩者分開的文章和操作手冊，因此在此我們只針對pbmc細胞的收集做一個概述。
pbmc存在于外周血中，可利用細胞分離技術從全血中分離出來。總的來說，pbmc只占全血樣本的一小部分（約1%），當被其他物質擠在一起時，很難進行研究。三種較常見的pbmc分離方法包括：密度梯度離心、熒光活化細胞分選（facs）、磁激活細胞分選(macs)，每一種血液分離方法都有自己的優點和缺點。
密度梯度離心密度梯度離心依靠物理特性，如大小和密度來分選細胞群。通過將樣品放入高速旋轉的離心機中，不同類型的細胞將通過與相似密度的顆粒分組來進行分類。密度較大的粒子會落到底部或外面，而密度較小的粒子會停留在中心或上升到頂部。對一個標準的全血樣本進行離心，將分離出血液成分的一般層，集中在試管底部的紅細胞(大約占總體積的45%)，中間層的灰白色涂層層——包含各種白細胞和血小板(大約占總體積的1%)，以及血漿——包含允許血液流動的水狀液體，隨著各種蛋白質和溶解的營養物質和氣體(大約占總體積的55%)在管的頂部。
根據所用采血管含有的成分，密度梯度離心也有三種方法。
檸檬酸鈉cpt管采血的細胞分離
檸檬酸鈉是一種抗凝劑：檸檬酸根可與血液中的鈣離子結合，生成可溶解性的絡合物。由于鈣離子在凝血過程中起到促進凝血作用，因此血液中的鈣離子濃度下降會阻止血液的凝結。
步驟：
1. 室溫(15℃~ 30℃)豎直存放血漿收集管，直到離心。
2. 離心前將試管輕輕倒轉8 - 10次，使細胞重新混合。
3. 將離心管置于水平轉子中，室溫(15℃~30℃)，1800 x g (rcf)離心30分鐘。轉速必須仔細計算。降速過程中不要使用剎車。應注意確保cpt管是正確地安裝在離心機中。
4. 在離心機停止后，小心地取出試管并放置在一個架子上。
5. 單個核細胞和血小板位于血漿層下方的白色層中(見圖1)。
6. 在不干擾細胞層的情況下，從每根cpt管中抽取血漿層。如果方案要求收集血漿，請參閱方案的具體文件。
7. 用移液管從每個試管中收集單個核細胞層，并將其轉移到50ml帶帽的塑料錐形離心管。
8. 如果收集3根或更少(≤3根)cpt管，將全部cpt管收集到的細胞層放入一個50ml離心管。
9. 如果收集的cpt管多于3根(>3)，則取其中2 - 3根cpt管的細胞層放入一個50ml離心管。不要將三個以上cpt管的細胞層組合在一起放入一個50ml離心管。重復此步驟，直到將所有cpt管的細胞層轉移到50ml離心管中，然后進行洗滌步驟。
圖1 cpt管離心結果
帶有預填充 frit 屏障的acd、nahep或edta管采集血液的細胞分離
在加入血液之前，目視檢查cstfb，看是否有液體在 frit上面。如果 frit上面有液體，將cstfb在1000 x g下離心30秒。如果有密度梯度離心后溶液仍在 frit上方，應吸除。
步驟：
1. 血液稀釋用于cstfb分離
血液與生理鹽水的比例約為2:1。每10 ~ 20ml全血使用一個50ml管(或每5 ~ 10ml全血用一個12 ~ 14ml管)。按要求使用盡可能多的cstfb來分配每個樣品的所有血液。
(1) 在每個cstfb上標上樣品識別號。
(2) 用無菌吸管向每個cstfb中加入生理鹽水溶液：50ml cstfb管加5ml生理鹽水。
(3) 輕輕混合全血，然后用無菌移液器將血液轉移到標記的cstfb中。
(4) 使用無菌移液器，用生理鹽水沖洗每個原始抗凝血管并轉移溶液沖洗量到cstfb，確保不超過總管體積(生理鹽水+全血)的限制：50ml管的總體積不應超過30ml。
(5) 小心蓋上cstfb。
2. cstfb密度離心和pbmc收集
(1) 保持試管直立，輕輕轉移到離心機上。
(2) 800 ~ 1000 x g, 15℃~ 30℃離心15分鐘，關閉剎車。(一些樣品在1000g離心pbmc分離的效果可以改善。如果降速過程中存在剎車，就會破壞分層。)
(3) 離心時，準備新無菌離心管；這將與上一步中使用的管子數量相同。用樣品識別號標記每個試管。
(4) 輕輕將cstfb從離心機中取出，以免擾亂各層。
(5) 離心使試管（包括 frit層）的內容物分成六個不同的層。
(6) 檢查管里是否有以下可能的問題。根據實驗室要求記錄觀察結果和采取的后續行動。
①、血漿+生理鹽水溶液層。
②、離心后在 frit上可見凝塊。
③、由于離心速度，時間或制動錯誤，pbmc層較差。pbmc層小而模糊，血漿+生理鹽水層可能略有混濁。
④、由于紅細胞計數或紅細胞比容低，在 frit上形成pbmc層。
(7) 每個樣品使用新的無菌移液管去除上層淡黃色血漿+鹽水溶液的組分，至云狀白色pbmc帶（位于血漿+鹽溶液層界面和透明分離介質溶液間）的上方約1~2厘米的位置。根據實驗室政策，丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色pbmc帶可通過上層小心插入移液器移至pbmc帶。）
(8) 使用無菌血清學移液器收集上述pbmc帶處的所有細胞。注意不要吸入多于必要的分離介質溶液。
(9) 將收集到的細胞從一個cstfb轉移到一個相應的、預標記的無菌離心管。管子可以預先添加鹽水溶液以節省時間（50ml管加25ml生理鹽水溶液）。之后進行洗滌步驟。
(10) 將含有剩余的紅細胞和分離介質cstfb重新蓋上蓋子。按照實驗室政策，將cstfb作為生物危害廢物丟棄。
圖2 pre-filled frit barrier管離心結果
手動密度梯度介質覆蓋或襯底分離細胞 （ficoll分離）
分離單核細胞常使用ficoll作為分離液的主要成分，ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400000，當密度為1.2g/ml時也未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。
通過ficoll密度梯度離心，紅細胞、粒細胞比重大于分離液比重，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分離液，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面上的細胞，就可從外周血中分離到單核細胞，并進行之后的培養與檢測。
步驟：
1. 血液稀釋
(1) 打開抗凝血管的蓋子。
(2) 在每根離心管上標上樣品識別號（50ml管加12 ~ 22ml血，15ml管加4至5ml血）。
(3) 將血液移入無菌、有標記的15或50ml離心管中，根據制備密度梯度的試劑盒說明加入足夠的生理鹽水來稀釋血液（血液與稀釋液的比例應為2:1）。
2. 密度梯度細胞分離
（兩種方法：（1）覆蓋overlay，先制備梯度在加樣品；（2）襯底underlay，先加樣品再加梯度。加完后蓋好蓋子。）
3. 淋巴細胞密度離心和pbmc收集
(1) 保持試管直立，輕輕地轉移到離心機。
(2) 按照說明書概述，在15~30°c條件下，400 x g離心30分鐘，關閉制動器。（如果降速過程中存在制動會破壞分離層。離心機制動器必須關閉以使分離干凈，并回收pbmc。）
(3) 離心使管內內容物分成四層。
圖3 ficoll密度梯度離心結果
(4) 在離心管進行離心時，準備新的無菌離心管。這將與上一步驟中使用的管子數量相同。用樣品識別號標記每個試管。
(5) 離心完成后從離心機上取下離心管。
(6) 如果看不到細胞層，確認離心機運轉正常。糾正你發現的任何問題。重新離心試管。記錄問題和在研究記錄中采取的行動。
①、如果再離心后細胞層仍然不可見，記錄，移除和丟棄鹽溶液上清，然后繼續。
②、如果血漿層非常渾濁，可能很難看到血漿層與密度梯度介質的界面。用10ml移液管除去界面上方的大部分血漿可改善淋巴細胞的收集，例如只留下0.5厘米的血漿層。
(7) 每份樣品使用新的無菌移液器，去除上層黃色血漿+生理鹽水溶液的組分，至渾濁白色pbmc帶的上方大約1~2cm的位置（位于血漿+生理鹽水溶液淡黃色組分和密度梯度分離介質溶液間）。按實驗室政策丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。（或者，上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色pbmc帶可通過上層小心插入移液器移至pbmc帶。）
(8) 使用無菌移液管，在pbmc帶（濁白處）收集所有細胞。注意不要吸入更多的分離介質溶液。
(9) 將收集到的細胞從一個錐形離心管轉移到另一個相應的、預標記的無菌離心管。離心管可以預先填充生理鹽水以節省時間。之后進行洗滌。
4. 重新蓋上裝有剩余紅細胞/分離物的錐形離心管。按照實驗室政策，將試管作為生物危害廢物進行培養基和丟棄。
流式細胞術涉及到流式細胞儀的使用的一種免疫細胞分離技術，流式細胞儀是一種根據大小、形狀和熒光亮度等特征標記不同顆粒的儀器。這種方法被稱為熒光激活細胞分選(facs)，它允許樣品流過一個管子，然后將成分分成不同的組。
facs需要昂貴的設備和受過適當訓練的人員。這種技術在分選需要許多不同群體的不同細胞樣本時很有用，但使用這種方法分離白細胞非常耗時。通常，在使用流式細胞術處理之前，樣品應首*行“制備”或清理，以分離原始樣品內容物的特定子集，這可以減少細胞分選所需的時間，因為機器將處理更小、更濃縮的樣品量。這樣還可以產生更多健康的、有活力的細胞，因為當處理時間大大減少時，自然細胞死亡就會減少。
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