DNA測(cè)序的基本原理及準(zhǔn)備樣品時(shí)的注意事項(xiàng)！
dna測(cè)序的基本原理及準(zhǔn)備樣品時(shí)的注意事項(xiàng)！
一、測(cè)序的基本原理
測(cè)序的基本原理是sanger末端終止法，在酶的作用下將原本是一條長(zhǎng)達(dá)數(shù)百堿基的片斷擴(kuò)增成數(shù)百條片斷，彼此間相差一個(gè)堿基。用電泳分離這些片斷后，再通過(guò)測(cè)序儀將這些信號(hào)轉(zhuǎn)變成峰圖，從而最終形成客戶所看到的測(cè)序序列和測(cè)序的峰圖。
目前通用的擴(kuò)增方式是通過(guò)pcr的方式進(jìn)行的起源；其原理簡(jiǎn)述如下：pcr類似于dna的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。
pcr由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
①模板dna的變性：模板dna經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴(kuò)增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
②模板dna與引物的退火(復(fù)性)：模板dna經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
③引物的延伸：dna模板--引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
采用pcr的方式擴(kuò)增目標(biāo)片斷具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、微量的樣品也可進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)
2、操作簡(jiǎn)便
3、縮短了測(cè)序樣品的準(zhǔn)備時(shí)間。
因此目前所有提供測(cè)序服務(wù)的公司都是采用pcr擴(kuò)增目標(biāo)片斷來(lái)進(jìn)行測(cè)序的。當(dāng)然由于測(cè)序反應(yīng)要求較普通pcr遠(yuǎn)為嚴(yán)格，因此在所用的酶和反應(yīng)體系方面均進(jìn)行了特殊處理。
二、測(cè)序的樣品要求
測(cè)序由于是要進(jìn)行特殊的pcr反應(yīng)的，因此對(duì)樣品的要求與其他試驗(yàn)的要求有所不同分別簡(jiǎn)述之：
1、樣品的純度：pcr具有短時(shí)間內(nèi)高效的擴(kuò)增能力，因此樣品的純度對(duì)反應(yīng)有至關(guān)重要的影響。當(dāng)樣品不純的時(shí)候，那些雜質(zhì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。這在pcr產(chǎn)物測(cè)序中表現(xiàn)的尤為明顯，在測(cè)序結(jié)果上表現(xiàn)為峰圖雜亂，過(guò)多的不可識(shí)別的堿基。
2、樣品的量：盡管測(cè)序反應(yīng)可以高效的擴(kuò)增待測(cè)得模板，使得測(cè)序所需要的模板量大大降低，但是當(dāng)限度的模板量也不能提供的話，會(huì)引起測(cè)序反應(yīng)的異常，表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)，峰圖弱，或者反應(yīng)中斷等。
3、樣品的形式：這里專指純化的pcr產(chǎn)物和質(zhì)粒樣品。正常情況下，溶解樣品時(shí)常用的溶液有以下幾種形式：水，tris 溶液，te（tris—edta）三種。當(dāng)采用te為溶劑的時(shí)候由于溶液中的edta可以干擾測(cè)序反應(yīng)的進(jìn)行，因此實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行測(cè)序時(shí)需要注意樣品的溶解方式。
三、不同樣品的要求及簡(jiǎn)介
1、樣品的形式：從測(cè)序角度來(lái)講是由實(shí)驗(yàn)者提供菌液的形式，由公司來(lái)提取質(zhì)粒，這樣可以保證dna樣品的數(shù)量和質(zhì)量。如果實(shí)驗(yàn)者提供的是質(zhì)粒或者是純化后的pcr產(chǎn)物，則需要說(shuō)明其濃度和溶解的方式（原因如上）
2、不同樣品的說(shuō)明：
（1）pcr產(chǎn)物：若是pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，需要實(shí)驗(yàn)者同時(shí)提供pcr的雙向引物各10ul（濃度>5um/ul），這是因?yàn)閜cr的引物要求與測(cè)序的引物有所不同，因此不能保證一條pcr引物就能夠測(cè)成功。雙向引物可以在一條引物無(wú)法測(cè)序的情況下，改用另一端的引物測(cè)序。這樣一來(lái)，實(shí)驗(yàn)者告知公司一下反應(yīng)的條件，以便測(cè)序公司可以及時(shí)調(diào)整測(cè)序反應(yīng)。（已純化）濃度 > 50ng/μl、體積> 10 μl；（未純化）濃度 > 100ng/μl、體積> 30 μl；引物要求：濃度>5um、體積>10 μl
（2）質(zhì)粒產(chǎn)物：需要提供明確的質(zhì)粒名稱，大小、濃度以及測(cè)序所用的引物名稱，如果是自帶引物測(cè)序（條件同pcr測(cè)序），也能夠標(biāo)明反應(yīng)的條件。質(zhì)粒的大小對(duì)于測(cè)序也有著一定的影響。樣品中，質(zhì)粒的總量不低于5ug。
（3）菌液：需要明確的標(biāo)明所用的抗生素類型和培養(yǎng)條件，以便樣品能夠培養(yǎng)和擴(kuò)增。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)，本站羅列了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及本公司自行研制的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照品及化學(xué)試劑，方便了客戶對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及化學(xué)試劑的查詢！所接所有訂單全部由上門(mén)自取改為快遞統(tǒng)一發(fā)貨，既快捷了外地客戶對(duì)產(chǎn)品的使用，又規(guī)范了公司內(nèi)部的庫(kù)房結(jié)構(gòu)！讓一站式標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的購(gòu)買(mǎi)更加精準(zhǔn)，高效！
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目前通用的擴(kuò)增方式是通過(guò)pcr的方式進(jìn)行的起源；其原理簡(jiǎn)述如下：pcr類似于dna的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。
pcr由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
①模板dna的變性：模板dna經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴(kuò)增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
②模板dna與引物的退火(復(fù)性)：模板dna經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
③引物的延伸：dna模板--引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
采用pcr的方式擴(kuò)增目標(biāo)片斷具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、微量的樣品也可進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)
2、操作簡(jiǎn)便
3、縮短了測(cè)序樣品的準(zhǔn)備時(shí)間。
因此目前所有提供測(cè)序服務(wù)的公司都是采用pcr擴(kuò)增目標(biāo)片斷來(lái)進(jìn)行測(cè)序的。當(dāng)然由于測(cè)序反應(yīng)要求較普通pcr遠(yuǎn)為嚴(yán)格，因此在所用的酶和反應(yīng)體系方面均進(jìn)行了特殊處理。
二、測(cè)序的樣品要求
測(cè)序由于是要進(jìn)行特殊的pcr反應(yīng)的，因此對(duì)樣品的要求與其他試驗(yàn)的要求有所不同分別簡(jiǎn)述之：
1、樣品的純度：pcr具有短時(shí)間內(nèi)高效的擴(kuò)增能力，因此樣品的純度對(duì)反應(yīng)有至關(guān)重要的影響。當(dāng)樣品不純的時(shí)候，那些雜質(zhì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。這在pcr產(chǎn)物測(cè)序中表現(xiàn)的尤為明顯，在測(cè)序結(jié)果上表現(xiàn)為峰圖雜亂，過(guò)多的不可識(shí)別的堿基。
2、樣品的量：盡管測(cè)序反應(yīng)可以高效的擴(kuò)增待測(cè)得模板，使得測(cè)序所需要的模板量大大降低，但是當(dāng)限度的模板量也不能提供的話，會(huì)引起測(cè)序反應(yīng)的異常，表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)，峰圖弱，或者反應(yīng)中斷等。
3、樣品的形式：這里專指純化的pcr產(chǎn)物和質(zhì)粒樣品。正常情況下，溶解樣品時(shí)常用的溶液有以下幾種形式：水，tris 溶液，te（tris—edta）三種。當(dāng)采用te為溶劑的時(shí)候由于溶液中的edta可以干擾測(cè)序反應(yīng)的進(jìn)行，因此實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行測(cè)序時(shí)需要注意樣品的溶解方式。
三、不同樣品的要求及簡(jiǎn)介
1、樣品的形式：從測(cè)序角度來(lái)講是由實(shí)驗(yàn)者提供菌液的形式，由公司來(lái)提取質(zhì)粒，這樣可以保證dna樣品的數(shù)量和質(zhì)量。如果實(shí)驗(yàn)者提供的是質(zhì)粒或者是純化后的pcr產(chǎn)物，則需要說(shuō)明其濃度和溶解的方式（原因如上）
2、不同樣品的說(shuō)明：
（1）pcr產(chǎn)物：若是pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，需要實(shí)驗(yàn)者同時(shí)提供pcr的雙向引物各10ul（濃度>5um/ul），這是因?yàn)閜cr的引物要求與測(cè)序的引物有所不同，因此不能保證一條pcr引物就能夠測(cè)成功。雙向引物可以在一條引物無(wú)法測(cè)序的情況下，改用另一端的引物測(cè)序。這樣一來(lái)，實(shí)驗(yàn)者告知公司一下反應(yīng)的條件，以便測(cè)序公司可以及時(shí)調(diào)整測(cè)序反應(yīng)。（已純化）濃度 > 50ng/μl、體積> 10 μl；（未純化）濃度 > 100ng/μl、體積> 30 μl；引物要求：濃度>5um、體積>10 μl
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（3）菌液：需要明確的標(biāo)明所用的抗生素類型和培養(yǎng)條件，以便樣品能夠培養(yǎng)和擴(kuò)增。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)，本站羅列了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及本公司自行研制的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照品及化學(xué)試劑，方便了客戶對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及化學(xué)試劑的查詢！所接所有訂單全部由上門(mén)自取改為快遞統(tǒng)一發(fā)貨，既快捷了外地客戶對(duì)產(chǎn)品的使用，又規(guī)范了公司內(nèi)部的庫(kù)房結(jié)構(gòu)！讓一站式標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的購(gòu)買(mǎi)更加精準(zhǔn)，高效！
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