流式細胞制備-磁珠細胞分選常見問題方案（陽性、陰性分選
細胞分選常見問題
問題一
為什么建議磁珠分選而不是流式分選？
1)磁珠分選需要的設備簡單，而流式分選需要配備分選型流式細胞儀，價格較為昂貴，而且流式分選對于操作員的技術要求很高，需要專門的培訓并有一定的經驗后才能很好地完成流式分選；
2)磁珠分選所需要的時間遠小于流式分選所需要的時間；
3)磁珠分選對于目的細胞的刺激比流式分選要小，流式分選過程中需要對目的細胞所在的液滴通電，并且需要經過一個強電場的區域，對目的細胞的刺激相對較大；磁珠分選只是讓細胞處于一個低磁場中，基本可以忽略對細胞的影響，從保持細胞活力的方面考慮，磁珠分選要優于流式分選。
因此，如果磁珠分選可以滿足實驗需求時，應盡量選擇磁珠分選的方法。
問題二
磁珠分選為什么要求細胞活性越高越好？
1)死細胞分泌dna，dna有粘性，會將磁珠標記細胞和非標記細胞粘在一起，如果是陽選會影響純度，如果是陰選會影響得率。
2)細胞活性低時可能會影響抗原抗體的結合效率。
問題三
磁珠分選buffer是什么？
automacs running buffer（自己配制：ph7.2 pbs，0.5％bsa、2mm edta，如需無菌，建議購買商品化buffer或紫外線照射，不建議高溫高壓滅菌）。
問題四
如果想分選的細胞有多個陽性marker怎么辦？
可以選擇磁珠分選陰選+陽選的方法，eg.分選小鼠脾臟naive cd4+t可以先用陰選的方法分到cd4+t細胞再用cd62l磁珠陽性分選；也可以用磁珠+流式的方法。
問題五
分選柱可以二次使用嗎？
不建議，主要是分選柱內填充的鐵珠在使用后易生銹。
問題六
分選柱應如何選擇？
不同的試劑盒對于ms/ls/ld柱的最大細胞上樣量和最大磁性細胞吸附量是不同的，建議一定要參考說明書；
此外，如分選的目的細胞較大（eg.巨核細胞或fibroblast），可考慮采用large cell colums。
磁珠分選-方案a：magnisort™陽性分選
引言
下述方案是magnisort™陽性分選試劑盒的通用操作指南。具體請參見試劑盒內的說明書。在陽性分選中，待分選的細胞首先與標記的抗體結合，然后被鏈酶親合素包被的磁珠捕獲。將細胞放入magnisort™磁座后，陽性細胞被磁場吸住，而陰性細胞仍游離在溶液中，可被棄掉。每個試劑盒中的化抗體和磁珠預先已滴定好最適濃度，為即用型試劑。
注意事項
注：magnisort™5ml磁座可產生強磁場。應遠離心臟起搏器、、磁性身份卡、手表、計算機顯示器、硬盤等物品，以免損壞。
細胞制備
1.在未特別說明的情況下，magnisort™陽性分選試劑盒已優化，適用于小鼠二級淋巴組織或正常人pbmc。
2.用于小鼠細胞時，建議用40μm的尼龍細胞篩清除碎屑，以使試劑盒發揮出最佳效果。
3.正常人pbmc的制備，參見“細胞制備-方案d：從全血中提取pbmc”（第28頁）。為使magnisort™試劑盒發揮最佳性能，建議洗滌白膜層，去除血小板。
4.向緩沖液中加入edta減少細胞聚集。
后續用于無菌培養
1. magnisort™陽性分選抗體和陽性分選磁珠中含有少量作為防腐劑。當使用不含的無菌緩沖液時，它不會影響細胞功能。需要根據測試判斷在特定實驗中的性能。
2.分選無菌細胞時應該在超凈工作臺中進行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無菌試管和無菌緩沖液。
提供的材料
?magnisort™陽性分選抗體，200次試驗，20μl/次試驗。2-8°c貯存。
?magnisort™陽性分選磁珠，4ml。2-8°c貯存。
所需其他材料
?細胞分選推薦使用的緩沖液：添加3%胎牛血清（fbs）和10mmedta的pbs或hank（hbss）。2-8°c貯存。
?magnisort™磁座，5ml。
?12 x 75 mm流式管(5 ml，bd falcon™，貨號352008或類似產品)。
?15ml離心管(bd falcon™，貨號352099或類似產品)
實驗步驟
1.用適當的細胞分離液，制備濃度為1x107細胞/100μl（1 x 108/ml）的淋巴細胞懸液。
注：細胞必須制成單細胞懸液。實驗前需要檢查樣本，必要時用渦旋法或移液器去除細胞團塊。
2.將所需數量的細胞（不能超過2 x 108個細胞）放入12 x 75 mm的5ml試管中。
3.每100μl細胞中加入20μlmagnisort™陽性分選抗體。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。
4.加入細胞分離液洗滌細胞，使其總體積達到4ml，在300xg下離心5分鐘。
5.棄上清，然后用細胞分離液重懸細胞至最初的體積。
注：細胞必須制成單細胞懸液，實驗前需要檢查樣本，必要時用渦旋或移液器去除細胞團塊。
6.每100μl細胞中加入20μlmagnisort™陽性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。
注：為確保最佳性能，將magnisort™陽性分選磁珠加入細胞之前必須充分混勻。將設定為1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打5次，或者采用渦旋的方式重懸磁珠。7.用細胞分離液將體積加至2.5ml。將設定為1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。
8.將試管插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。
9.拿起磁座將試管內的上清液倒入廢液容器內；這些是不需要（未結合）的細胞。將試管倒置1秒鐘，然后回正。注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會降低回收率。如果需要也可以收集起結合細胞。
10.從磁座中取出試管并重復7-9步兩次，總共洗滌細胞3次。
11.從磁座中取出含目標細胞的試管，加入1ml細胞分離液。沿著試管側壁加入緩沖液，洗滌試管側壁。此時，試管內就是分選的陽性細胞，備用。
磁珠分選-方案b：magnisort™陰性分選
簡介
以下是magnisort™陰選試劑盒的通用操作指南，該試劑盒適用于細胞進行陰性分選。具體請參見每個試劑盒內的說明書。在陰性分選中，不需要的細胞與bition化抗體混合液結合，然后加入鏈霉親和素包被的磁珠。將細胞放入magnisort™磁座后，不需要的細胞被磁場吸住，而需要的細胞游離在溶液中，將其倒出后即可使用。每個試劑盒中的ition化抗體和磁珠已預先滴定好最適濃度，為即用型試劑。
注意事項
注意：magnisort™5ml磁座可產生強磁場。應遠離心臟起搏器磁性身份卡、手表、計算機顯示器、硬盤等物品，以免損壞。
細胞制備
1.在未特別指明的情況下，magnisort™陰選試劑盒已經過優化，專門適用于小鼠二級淋巴組織或正常人pbmc。
2.用于小鼠細胞時，建議用40μm的尼龍細胞篩清除碎屑，以使試劑盒發揮出最佳效果。
3.正常人pbmc的制備，參見“細胞制備-方案d：從全血中提取pbmc”（第28頁）。為使magnisort™試劑盒發揮最佳性能，建議洗滌白膜層，去除血小板。
4.緩沖液中加入edta減少細胞聚集。
后續用于無菌培養
1. magnisort™陰選抗體混合液和陰性分選磁珠中含有少量作為防腐劑。當使用不含的無菌緩沖液時，它不會影響細胞功能。需要根據測試判斷在特定實驗中的性能。
2.分選無菌細胞時應該在超凈工作臺中進行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無菌試管和無菌緩沖液。
提供的材料
?magnisort™陰選抗體混合液，200次實驗，20μl/次試驗。2-8°c貯存。
?magnisort™陰性分選磁珠，4ml。2-8°c貯存。
所需其他材料
?細胞分選推薦使用的緩沖液：pbs或添加3%fbs和10mmedta的hbss。2-8°c貯存。
?magnisort™磁座，5ml
?12 x 75 mm流式管(5 ml, bd falcon™,貨號352008或類似產品)
實驗步驟
1.用適當的細胞分離液，制備濃度為1x107細胞/100μl（1 x 108/ml）的單細胞懸液。
注：細胞必須制成單細胞懸液。實驗前需要檢查樣本，必要時用渦旋法或移液器去除細胞團塊。
2.將所需數量的細胞（不能超過2 x 108個細胞）放入12 x 75 mm的5ml試管中。
3.每100μl細胞中加入20μlmagnisort™陰選抗體混合液。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。
4.用細胞分離液洗滌細胞，使其總體積達到4ml，300xg離心5分鐘。
5.棄上清，然后用細胞分離液重懸細胞至最初的體積。
注：細胞必須制成單細胞懸液。實驗前需要檢查樣本，必要時用渦旋法或移液器去除細胞團塊。
6.向每100μl細胞中加入20μl magnisort™陰性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育5分鐘。
注：為確保最佳性能，將magnisort™陰性分選磁珠加入細胞之前必須充分混勻。將設定為1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打5次，重懸磁珠，不能渦旋。
7.用細胞分離液將體積加至2.5ml。將設定為1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。
8.將試管插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。
9.拿起磁座以連續的動作將試管內的上清液倒入一支新的12x75mm 5ml試管中并將磁座內的試管倒置1秒鐘，然后回正。
注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會降低未結合細胞的純度。
10.將磁座中的試管丟棄。
11.此時，新5ml 12 x 75 mm試管中的陰性細胞即為分選后的目的細胞，備用。
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3)磁珠分選對于目的細胞的刺激比流式分選要小，流式分選過程中需要對目的細胞所在的液滴通電，并且需要經過一個強電場的區域，對目的細胞的刺激相對較大；磁珠分選只是讓細胞處于一個低磁場中，基本可以忽略對細胞的影響，從保持細胞活力的方面考慮，磁珠分選要優于流式分選。
因此，如果磁珠分選可以滿足實驗需求時，應盡量選擇磁珠分選的方法。
問題二
磁珠分選為什么要求細胞活性越高越好？
1)死細胞分泌dna，dna有粘性，會將磁珠標記細胞和非標記細胞粘在一起，如果是陽選會影響純度，如果是陰選會影響得率。
2)細胞活性低時可能會影響抗原抗體的結合效率。
問題三
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問題四
如果想分選的細胞有多個陽性marker怎么辦？
可以選擇磁珠分選陰選+陽選的方法，eg.分選小鼠脾臟naive cd4+t可以先用陰選的方法分到cd4+t細胞再用cd62l磁珠陽性分選；也可以用磁珠+流式的方法。
問題五
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問題六
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此外，如分選的目的細胞較大（eg.巨核細胞或fibroblast），可考慮采用large cell colums。
磁珠分選-方案a：magnisort™陽性分選
引言
下述方案是magnisort™陽性分選試劑盒的通用操作指南。具體請參見試劑盒內的說明書。在陽性分選中，待分選的細胞首先與標記的抗體結合，然后被鏈酶親合素包被的磁珠捕獲。將細胞放入magnisort™磁座后，陽性細胞被磁場吸住，而陰性細胞仍游離在溶液中，可被棄掉。每個試劑盒中的化抗體和磁珠預先已滴定好最適濃度，為即用型試劑。
注意事項
注：magnisort™5ml磁座可產生強磁場。應遠離心臟起搏器、、磁性身份卡、手表、計算機顯示器、硬盤等物品，以免損壞。
細胞制備
1.在未特別說明的情況下，magnisort™陽性分選試劑盒已優化，適用于小鼠二級淋巴組織或正常人pbmc。
2.用于小鼠細胞時，建議用40μm的尼龍細胞篩清除碎屑，以使試劑盒發揮出最佳效果。
3.正常人pbmc的制備，參見“細胞制備-方案d：從全血中提取pbmc”（第28頁）。為使magnisort™試劑盒發揮最佳性能，建議洗滌白膜層，去除血小板。
4.向緩沖液中加入edta減少細胞聚集。
后續用于無菌培養
1. magnisort™陽性分選抗體和陽性分選磁珠中含有少量作為防腐劑。當使用不含的無菌緩沖液時，它不會影響細胞功能。需要根據測試判斷在特定實驗中的性能。
2.分選無菌細胞時應該在超凈工作臺中進行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無菌試管和無菌緩沖液。
提供的材料
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所需其他材料
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?15ml離心管(bd falcon™，貨號352099或類似產品)
實驗步驟
1.用適當的細胞分離液，制備濃度為1x107細胞/100μl（1 x 108/ml）的淋巴細胞懸液。
注：細胞必須制成單細胞懸液。實驗前需要檢查樣本，必要時用渦旋法或移液器去除細胞團塊。
2.將所需數量的細胞（不能超過2 x 108個細胞）放入12 x 75 mm的5ml試管中。
3.每100μl細胞中加入20μlmagnisort™陽性分選抗體。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。
4.加入細胞分離液洗滌細胞，使其總體積達到4ml，在300xg下離心5分鐘。
5.棄上清，然后用細胞分離液重懸細胞至最初的體積。
注：細胞必須制成單細胞懸液，實驗前需要檢查樣本，必要時用渦旋或移液器去除細胞團塊。
6.每100μl細胞中加入20μlmagnisort™陽性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。
注：為確保最佳性能，將magnisort™陽性分選磁珠加入細胞之前必須充分混勻。將設定為1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打5次，或者采用渦旋的方式重懸磁珠。7.用細胞分離液將體積加至2.5ml。將設定為1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。
8.將試管插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。
9.拿起磁座將試管內的上清液倒入廢液容器內；這些是不需要（未結合）的細胞。將試管倒置1秒鐘，然后回正。注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會降低回收率。如果需要也可以收集起結合細胞。
10.從磁座中取出試管并重復7-9步兩次，總共洗滌細胞3次。
11.從磁座中取出含目標細胞的試管，加入1ml細胞分離液。沿著試管側壁加入緩沖液，洗滌試管側壁。此時，試管內就是分選的陽性細胞，備用。
磁珠分選-方案b：magnisort™陰性分選
簡介
以下是magnisort™陰選試劑盒的通用操作指南，該試劑盒適用于細胞進行陰性分選。具體請參見每個試劑盒內的說明書。在陰性分選中，不需要的細胞與bition化抗體混合液結合，然后加入鏈霉親和素包被的磁珠。將細胞放入magnisort™磁座后，不需要的細胞被磁場吸住，而需要的細胞游離在溶液中，將其倒出后即可使用。每個試劑盒中的ition化抗體和磁珠已預先滴定好最適濃度，為即用型試劑。
注意事項
注意：magnisort™5ml磁座可產生強磁場。應遠離心臟起搏器磁性身份卡、手表、計算機顯示器、硬盤等物品，以免損壞。
細胞制備
1.在未特別指明的情況下，magnisort™陰選試劑盒已經過優化，專門適用于小鼠二級淋巴組織或正常人pbmc。
2.用于小鼠細胞時，建議用40μm的尼龍細胞篩清除碎屑，以使試劑盒發揮出最佳效果。
3.正常人pbmc的制備，參見“細胞制備-方案d：從全血中提取pbmc”（第28頁）。為使magnisort™試劑盒發揮最佳性能，建議洗滌白膜層，去除血小板。
4.緩沖液中加入edta減少細胞聚集。
后續用于無菌培養
1. magnisort™陰選抗體混合液和陰性分選磁珠中含有少量作為防腐劑。當使用不含的無菌緩沖液時，它不會影響細胞功能。需要根據測試判斷在特定實驗中的性能。
2.分選無菌細胞時應該在超凈工作臺中進行，并使用帶蓋的聚苯乙烯無菌試管和無菌緩沖液。
提供的材料
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所需其他材料
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實驗步驟
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注：細胞必須制成單細胞懸液。實驗前需要檢查樣本，必要時用渦旋法或移液器去除細胞團塊。
2.將所需數量的細胞（不能超過2 x 108個細胞）放入12 x 75 mm的5ml試管中。
3.每100μl細胞中加入20μlmagnisort™陰選抗體混合液。渦旋5次混勻。室溫孵育10分鐘。
4.用細胞分離液洗滌細胞，使其總體積達到4ml，300xg離心5分鐘。
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6.向每100μl細胞中加入20μl magnisort™陰性分選磁珠。渦旋5次混勻。室溫孵育5分鐘。
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7.用細胞分離液將體積加至2.5ml。將設定為1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打3次，使其混勻。不能渦旋。
8.將試管插入磁座中間的孔底，室溫孵育5分鐘。
9.拿起磁座以連續的動作將試管內的上清液倒入一支新的12x75mm 5ml試管中并將磁座內的試管倒置1秒鐘，然后回正。
注：切勿吸干或搖晃倒置后的試管，否則會降低未結合細胞的純度。
10.將磁座中的試管丟棄。
11.此時，新5ml 12 x 75 mm試管中的陰性細胞即為分選后的目的細胞，備用。
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