落射熒光干涉和吸收濾光片組合位于一個激發塊(或光學模塊)中,包括激發濾光片,雙色分束器(通常稱為反射鏡)和屏障(或激發)濾光片,如圖1(a)所示。使用本指南選擇合適的濾光片組,以匹配在寬視野熒光顯微鏡研究中使用的生色團的光譜激發和激發特性。典型的高性能帶通激發藍色激發濾光片組合的光譜圖作為示例在圖1(b)中給出。尼康熒光濾光片組合分別提供窄,中和寬通帶激發塊,并具有帶通或長通頻譜特性的相應激發濾波器。
圖1-熒光濾光片組合光譜圖
紫外線激發 -尼康紫外線激發熒光濾光片產品組合中包含四種精心平衡的組合,這些組合包含帶通或長通激發(屏障)濾光片,能夠選擇性地隔離可見,深藍色,綠色和紅色的狹窄或寬闊區域的熒光波長。這些濾光片組合覆蓋了330至380納米的激發波長范圍,通帶寬度分布為10、40和50納米。三種組合使用相同的雙色鏡,而第四組具有較低波長截止的鏡面,以與其更窄的激發帶一致。紫外線濾光片組包含長通或單帶通濾光片。
紫羅蘭色激發 -尼康紫羅蘭色激發熒光濾光片系列包括三種組合,分別包含帶通濾光片或長通激發濾光片(屏障),這些濾光片能夠選擇性地隔離藍,綠和紅色波長的狹窄或較寬區域的熒光激發。這些組合覆蓋了379-420納米之間的激發波長范圍,帶通寬度分布分別為10、22和40納米。兩種組合使用相同的雙色鏡,而第三組使用的截止波長較低的鏡與其較短波長的激發帶一致。
藍紫色激發 -尼康藍紫色激發熒光濾光片產品組合中包含四種組合,包括帶通或長通激發(阻擋)濾光片,能夠選擇性地隔離通過青色,綠色和綠色的狹窄或寬闊區域的熒光激發紅色波長。這些互補濾光片組的激發波長范圍在400-446納米之間,帶通寬度分布為10、20和40納米。三種組合使用相同的雙色鏡,而第四組具有更高的截止波長(5納米)以與其其他組件一致的鏡。
藍色激發 - 尼康藍光激發熒光濾光片補充劑由六個平衡組合組成,包含帶通或長通激發(屏障)濾光片,能夠通過綠色,黃色,紅色和近紅外的窄帶或寬帶選擇性地隔離熒光激發光譜區域。這些濾光片組的激發波長范圍在420至495納米之間,帶通寬度分布為20、30、40和70納米。五個組合使用相同的雙色鏡,而第六個組合使用了較低波長截止的鏡以增加獲取的信號。用于尼康藍色激發濾光片組合的帶通屏障濾光片的光譜寬度均為40納米。激發塊之一(b-3a)設計用于鹵素鎢燈照明。
綠色激發 - 尼康綠色激發熒光濾光片組合系列包括六個模塊,這些濾光片結合了單帶通或長通激發(阻擋)濾光片,能夠選擇性地隔離黃色,橙色,紅色和近紅外光譜區域的窄帶或寬頻帶內的熒光。這些濾光片組合的激發波長范圍在510到560納米之間,通帶寬度分布為10、25、30和50納米(包括窄,中和寬激發帶)。三種組合使用相同的雙色鏡(565納米),而其他三種具有更高的波長截止值(570或575納米)的鏡。六個尼康綠色激發濾光片組中的兩個包含帶寬為60和75納米的帶通勢壘濾光片。
黃色激發 - 尼康公司的黃色激發熒光濾光片組合包括兩個平衡組,這些濾光片結合了單個帶通(屏障)濾光片,能夠選擇性地隔離橙色到紅色光譜區域內的熒光激發。這些互補濾光片組合的激發波長范圍為532至587納米,通帶寬度為40和55納米。兩種組合都使用相同的長通二色鏡(切入595納米)。兩個尼康黃色激發濾光片組包含帶寬為60和75納米的帶通勢壘濾光片。
紅色激發 - 尼康紅色激發熒光濾光片組合類別包括一個單獨的模塊,該模塊結合了一個帶通激發(屏障)濾光片,能夠選擇性地隔離在深紅色至近紅外光譜區域中發生的熒光激發。屏障濾波器的通帶以700納米為中心,帶寬為75納米(663至738納米)。涵蓋橙色和紅色波長的寬60納米激發帶覆蓋590至650納米的光譜范圍。所述的cy5 hyq組合采用具有長通二色鏡的切口上的660個納米,這比帶通激發截止更高10個納米的波長。
黃色熒光蛋白(yfp)激發 - 尼康黃色熒光蛋白熒光濾光片類別包含一個高性能的平衡組合,可有效地將三個綠色熒光蛋白(gfp)濾光片組提供的熒光蛋白檢測功能擴展到更長的增強波長gfp的黃色變體(yfp和eyfp)。該yfp hyq濾光片組合采用相對較窄的通帶激發和激發(屏障)濾光片,其設計與增強型黃色熒光蛋白的特定光譜特征相對應,并使yfp衍生物的熒光激發能夠與其他熒光蛋白分開進行評估。
雙通激發 - 尼康雙通熒光濾光片產品組合包括三個精心平衡的組合,其中包含雙通通激發和激發(阻擋)濾光片,這些濾光片被合并到一個元件中,該元件能夠同時從兩個熒光團中選擇性地分離出熒光激發。每個濾光片組都針對特定的熒光染料對而設計,以實現良好性能,盡管它們對具有相似吸收和激發光譜曲線的熒光探針對也同樣有效。利用精確的波段選擇,在反射和透射區域之間進行陡峭的帶通過渡,可以以小的交叉干擾將多個激發和激發信號分開。
三通激發 - 尼康提供的三通激發帶熒光濾光片包括兩個平衡塊,其中包含三通帶通激發和激發(阻擋)濾光片,能夠同時從三個熒光團中選擇性分離出熒光。每個濾波器組都針對特定的三熒光染料套件而設計,以實現良好性能,盡管它們對于具有相似吸收和激發光譜曲線的備用探頭組合也同樣有效。利用精確的波段選擇,在反射和透射區域之間進行陡峭的帶通過渡,將多個激發和激發信號分離開來,從而將干擾降到低。
hyq激發 -尼康hyq熒光濾光片組合組包含四個精心平衡的高性能套件,所有這些套件均集成了帶通激發(屏障)濾光片,用于選擇性隔離有限波長范圍內的熒光。每個hyq濾鏡組的名稱都反映了其主要設計的熒光染料的名稱,但是在其各自的激發范圍內,每種組合都可以應用于各種合適的熒光染料。
尼康熒光濾光片組合列表尼康采用的濾鏡命名法可追溯到1990年代初。當時,所有尼康互補濾鏡組合都是使用硬涂層濺射技術生產的,但是許多當前可用的濾鏡都利用了較新的較軟的鍍膜方法。盡管軟涂層較易受濕氣和熱降解的影響,并且比硬涂層濾光片必須更小心地處理,但它們顯示出更高的阻隔值光學密度,并且更易于微調特定的波長帶。了解尼康濾鏡組合代碼的命名法提供了一種機制,可以快速確定特定的組對于特定的熒光團是否可以充分發揮作用。
尼康專有的字母數字濾波器名稱代碼中的個字母表示波長激發光譜區域(例如uv,v,b和g,分別是紫外線,紫羅蘭,藍色和綠色的簡單縮寫)。激發代碼后的數字與激發濾波器的通帶寬度有關:1表示窄帶激發,2表示中頻帶和寬帶激發,3表示非常寬帶的激發。后,激發帶通大小數字后面的一個或多個字母標識了屏障濾波器的特性。代號字母a表示截止波長的標準長通屏障濾光片,而b表示長通激發濾光片的截止波長值較高。帶通激發濾波器用字母e標識(指術語“增強型”),以表示它們在消除交叉方面的優越性能。在e/c激發塊是設計為與特定的探針,如dapi,fitc,tritc,和德克薩斯紅良好性能軟涂層干擾的組合。
紫外線激發uv-2e/c - uv-2e/c濾光片組合設計為用于紫外線熒光的尖銳截止濾光片。濾波器是軟涂層類型的,旨在產生高信噪比。此組合中使用的窄帶通屏障濾光片旨在顯著減少或*消除綠色和紅色可見波長。
uv-1a - uv-1a組合設計為用于紫外線熒光的濾光片,具有窄的激發帶通(僅使用汞光譜的i線)和窄的二色鏡通帶,可大程度地減少自發熒光和光漂白。
uv-2a - uv-2a濾光片組合被設計為用于紫外線熒光的標準濾光片,并且是尼康調色板中設置的亮的紫外線濾光片。
uv-2b - uv-2b組合被設計為用于紫外線熒光的通用濾光片,與uv-2a濾光片組合相比,它提供了更暗的背景和更好的對比度。
紫羅蘭色激發v-1a - v-1a濾光片組合設計為帶窄帶通區域的紫光熒光激發濾光片,可大程度地減少自發熒光。長通激發濾光片允許檢測各種熒光染料波長。
v-2a - v-2a組合設計為多功能性標準紫色熒光濾光片。使用中等激發帶通和長通激發濾光片,所產生的圖像是尼康紫色濾光片組中亮的。
bfp(藍色熒光蛋白) - bfp濾波器塊結合了窄的激發帶用帶通的激發濾光片,以限制自體熒光以及來自紅色和綠色的熒光團排除激發的檢測。這種濾光片組合非常適合對藍色熒光蛋白衍生物成像。
藍紫色激發bv-1a -bv-1a濾光片組合設計為用于藍紫色熒光激發的濾光片,其帶寬非常窄,可大程度地減少樣品的自發熒光。長通激發濾光片允許檢測各種熒光染料波長。
bv-2a - bv-2a組合設計為標準的藍紫色熒光濾光片。使用中等激發濾光片帶通和長通激發濾光片,這種組合所產生的圖像是尼康藍紫色濾光片組中亮的。
bv-2b - bv-2b組合設計為藍紫色熒光的濾光片,與標準bv-2a濾光片組合相比,可提供更暗的背景和更高的對比度。
cfp(青色熒光蛋白) - cfp濾波器塊結合了一個帶通的激發濾光片,以限制自體熒光,以及排除的紅色,黃色和綠色的許多發光的熒光染料檢測窄激發帶寬。
藍色激發b-1a - b-1a濾光片組合設計有較窄的激發通帶,以減少自發熒光和光致漂白。長通屏障(激發)濾光片能夠傳輸來自綠色,黃色,橙色和紅色熒光團的信號,這些信號在對應于激發帶通窗口的上部藍色波長區域中具有明顯的吸收。
b-2a - b-2a濾鏡組合是尼康藍光激發組中設置的標準濾鏡。與b-1a組合相比,其設計結合了寬的激發帶通,從而為熒光團提供了更大的吸收窗口,并且該裝置還具有較低的雙色鏡和阻隔濾光片截止波長,與b相比,產生了增強的圖像亮度-1a濾波器組。
b-3a - b-3a濾光片組合使用了與b-1a套裝相同的雙色鏡和長通激發濾光片,但采用了非常寬的激發帶,使其適用于鹵鎢燈。這種結合使得能夠傳輸來自綠色,黃色,橙色和紅色熒光團的大量信號,這些熒光團在藍色波長區域具有吸收帶。
b-1e - b-1e濾光片組合是藍色熒光激發系列中三組之一,該濾光片與帶通濾光片相反,是利用帶通的,主要區別在于激發帶的寬度。每個帶通屏障濾波器組提供的性能均適用于對標有異硫氰酸熒光素(fitc)的標本進行成像(綠色激發),同時阻止黃色,橙色和紅色激發。的b-1e組合與所述帶通激發(阻擋)濾波器結合使用窄帶通激發濾光片。
b-2e - b-2e濾光片組合采用寬激發帶通,其波長比b-1e組的激發帶低20納米。b-1e和b-2e濾鏡組合中的雙色鏡和帶通屏障濾鏡規格相同。
b-2e/c - b-2e/c激發塊組合使用的介質寬度的激發帶結合相比略微降低激發帶通波長區域b-1e和b-2e集。該性能經過優化,可檢測多種標記實驗中使用的多種流行的熒光團,同時提供了更好的黃色到紅色波長的排除。
綠色激發g-1a-用于綠色波長激發的g-1a濾光片組合設計有狹窄的激發帶通,以減少自發熒光并大程度地減少樣品輻射的暴露。長通屏障(激發)濾光片能夠傳輸黃色,橙色和紅色熒光團的信號,這些熒光團在中心綠色波長區域具有明顯的吸收率。
g-1b - g-1b濾波器組合具有相似部件簡檔的g-1a組,納入窄激發帶通,以減少自體熒光和試件破壞,但具有不同的二色鏡和激發濾光器切口上的波長。激發濾光片截止到較長波長的偏移會產生圖像,由于增加了對黃色激發的阻擋,因此圖像顯得較紅。
g-2a - g-2a濾光片組合配置為標準的綠色濾光片模塊,具有寬的激發通帶,適用于由綠色波長激活的大量熒光團。長通激發濾光片允許檢測比黃色光譜區域更長的所有熒光波長。
g-2b - g-2b濾波器組合的設計具有與g-2a濾波器模塊相同的激發特性。但是,在使用更高的雙色鏡和激發濾光片截止波長的情況下,g-2b套裝可產生背景更暗,顏色向紅色偏移的圖像。
g-2e/c - g-2e/c濾光片組合設計用于良好性能,可與多種用于多種標記實驗的流行熒光探針配合使用。窄激發帶通提供選擇性激發,而帶通激發濾光片則減少了以紅色和近紅外激發的熒光團的干擾。
cy3 hyq - cy3綠色激發濾光片組合的配置與g-2e/c裝置相似。但是,隨著激發通帶的擴大和激發帶通的擴大以涵蓋更低的波長,cy3濾光片塊產生的圖像會更亮一些,并反映出更多黃色光譜區域激發的檢測。
黃色激發y-2 /c - 用于黃色波長激發的y-2e/c濾光片組合被設計為與德州紅和cy3.5一起使用的濾光片套件,盡管其激發帶寬跨越了大多數黃色波長(重疊一部分) (綠色區域),則該套色可以與一系列其他熒光染料一起使用。帶通屏障濾光片可傳輸來自激發橙色和橙色紅色熒光的信號,同時消除大多數紅色和近紅外激發。
texas red hyq - texas red hyq濾鏡組合具有與y-2e/c裝置相似的組件配置,但具有更寬的激發和激發帶通窗,這使它可以傳輸更多的能量并產生相對明亮的圖像。由于激發濾光器通帶擴展到紅色光譜區域中的較長波長,因此所得圖像還反射了其他紅色熒光信號。
紅色激發cy5 hyq - 用于紅色波長激發的cy5 hyq濾光片組合旨在提供熒光團cy5的高能量激發,盡管寬激發范圍(黃橙色至紅色)允許該裝置與各種熒光染料一起使用。反射區和透射區之間的陡峭濾波器過渡可與寬帶寬使用帶來的高亮度水平相結合,從而保持信號分離。帶通屏障濾波器將信號從遠紅外傳輸到近紅外,該波長范圍是使用電子檢測器(例如不帶紅外濾光片的光電倍增管和ccd攝像機)有效地檢測到的。
雙通激發dapi-fitc - dapi-fitc濾光片組合設計用于同時檢測熒光染料dapi和fitc或具有類似光譜特性的其他配對熒光探針的激發。雙重窄的激發帶和激發帶對應于紫色激發的特定區域以及相應的藍色激發,并且藍色激發耦合到綠色激發。
fitc-tritc - fitc-tritc濾光片組合設計用于同時檢測熒光染料fitc和tritc或光譜相似的探針對的激發。帶通激發和激發濾波器允許兩個信號通道,一個對應于藍色激發和綠色激發的特定狹窄區域,另一個對應于綠色激發和橙紅色激發。
fitc-texas red - fitc-德克薩斯紅濾波器組合被設計有用于藍色激發和綠色激發稍微不同的帶通區相比,當fitc-tritc集,允許fitc的更有效的激發。這些偏移符合德克薩斯紅(綠色激發;紅色激發)波段的波長范圍稍高的情況。多個帶通區域以小的串擾提供了良好檢測,可同時顯示fitc和texas red或光譜相似的熒光團對。
三通激發dapi-fitc-tritc - dapi-fitc-tritc濾光片組合旨在用于同時檢測熒光染料dapi,fitc和tritc或具有相似光譜特性的其他探針組合的激發。三個窄的激發帶和激發帶分別對應于具有相應的藍色激發,耦合到綠色激發的藍色激發以及具有橙紅色激發的綠色激發的紫色激發的特定區域。
dapi-fitc-texas red - 與標準dapi-fitc-tritc相比,dapi-fitc-德克薩斯紅濾光片組合設計的通帶區域略有不同,紫色激發-藍色激發,藍色激發-綠色激發。相對于tritc的值,此設計旨在更好地符合texas red所需的更高激發和激發波長。多個帶通區域可提供良好的檢測,同時具有小的交叉和噪聲,可同時顯示dapi,fitc和texas red或光譜相似的熒光團組合。
hyq激發塊組合tritc hyq - 用于綠色波長激發的tritc hyq濾光片組合旨在提高tritc和dii等熒光染料的性能。與本應用中通常使用的一些綠色激發光相比,更寬的激發通帶和紅移雙色鏡截止信號為這些熒光團提供了更高的信號水平,并允許更好地檢測dsred熒光蛋白變體和遠紅色熒光hcred蛋白。
cy3 hyq - cy3 hyq綠色激發濾光片組合具有與g-2e/c裝置相似的組件特性,盡管它通過擴展的通帶窗產生增加的激發和激發能量。此外,激發通帶延伸到較低的波長(進入黃色),從而導致圖像既明亮,又偏黃橙色。這是用于檢測花青熒光探針cy3的推薦濾光片組合,尤其是在多標記技術中,它可以減少來自遠紅光和近紅外光的熒光團的干擾。
texas red hyq - texas red hyq濾光片組合經過優化,可與熒光探針texas red和cy3.5配合使用,其激發和激發通帶比類似的y-2e/c集寬。與y-2e/c裝置相比,由于得到的信號電平更高,并且激發通帶擴展到了更長的波長,因此這種組合產生的圖像在色調上更明亮,更紅。在德克薩斯紅hyq組合提供了一種用于發光探針在超過的上限波長改進的性能的y 2e / c的激發帶,同時限制從熒光團激發的深紅色和近紅外的干擾。
cy5 hyq - cy5 hyq濾光片組合是為高能紅色波長激發而設計的尼康套裝,盡管針對熒光團cy5進行了優化,但寬泛的黃橙色至紅色激發范圍適用于使用各種熒光染料。與激發濾光片通帶相對應的在從近紅外到近紅外波長產生的熒光在很大程度上是人眼看不見的,而有效的檢測則需要使用光電倍增管或ccd攝像機。寬的濾波器帶通區域,加上陡峭的導通和截止過渡,可保持hyq濾波器系列的大信號分離度和信噪比。
熒光蛋白激發塊組合endow gfp長通激發(fgp(r)-lp) - endow gfp長通激發濾波器的組合是endowgfp帶通濾波器組的長通版本和由杜克大學的sharyn endow博士設計。該濾光片組可用于利用wtgfp和egfp進行熒光研究。與該系列中的其他濾光片一起,設計該套件的目的是增加次級熒光強度(亮度),而不會相應地增加噪聲水平。通過增加激發和激發濾波器中的干涉腔的數量來創建更陡峭的通帶,從而使濾波器頻譜之間更加接近。由此產生的更寬和更陡峭的濾光片光譜使該裝置可以提供更多的激發并捕獲更多的熒光強度。
endow gfp帶通激發(fgp(r)-bp) - endow gfp帶通激發(fgp(r)-bp)濾波器的組合是endowgfp長通濾波器組的帶通版本和由杜克大學的sharyn endow博士設計。該濾光片組可用于利用wtgfp和egfp進行熒光研究,并且是分布廣的gfp濾光片組之一。
piston gfp帶通激發 - piston gfp帶通激發濾波器組合是范德比爾特大學的david piston博士設計的帶通濾波器組。激發濾光片具有窄帶通,可用于定量egfp(綠色熒光蛋白)熒光,同時避免波長超過540納米的自發熒光。
黃色熒光蛋白帶通激發(yfp hyq) - 尼康黃色熒光蛋白yfp hyq濾光片套件設計用于在藍綠色光譜區域中的窄(20納米)波長帶上透射激發光,并激發綠色到黃色在30納米帶通區域內進行檢測。該模塊經過優化,可用于yfp成像,同時在雙重染色技術中仍可區分青色熒光蛋白。
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