植物總RNA快速提取試劑盒的使用說明
植物總rna快速提取試劑盒
產品貨號：26125
產品規格：20t/50t
產品簡介：
本試劑盒采用的方法改變傳統一次性裂解的作法，對材料連續進行兩次裂解，并確保rna不被降解，有效地解離核蛋白與核酸的復合物。使用本試劑盒能在2h內完成rna的提取工作，并得到質量較高的產品，通過瓊脂糖凝膠電泳可以直觀地看到，條帶清晰，不拖尾。
本試劑盒可從植物組織(農作物、水果、花草)中，快速提取總rna，可同時處理大量不同樣品。提取的總rna純度高，基本沒有基因組、蛋白和其它雜質的污染，可用于rt-pcr、real time rt- pcr、芯片分析、northern blot、dot blot、polya篩選、體外翻譯、rnase保護分析和分子克隆等多種下游實驗。
產品組成：
產品組成
20t
50t
保存條件
裂解液ⅰ
15ml
37.5ml
室溫
裂解液ⅱ
12ml
30ml
室溫
去蛋白液
13ml
32.5ml
室溫
緩沖液
8ml
20ml
室溫
提取液
15ml
37.5ml
室溫
分離液
5ml
12.5ml
室溫
洗滌液
12ml
30ml
室溫
rnase-free ddh2o
2ml
5ml
室溫
rnase-free離心管
80個
200個
室溫
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
儲存事項：
1. 不合適的儲存于低溫(4℃或者-20℃) 會造成溶液沉淀， 影響使用效果，因此運 輸和儲存均在室溫下(15-25℃)進行。
2. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、ph值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
預防rnase污染：
1. 經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致rnase污染。
2. 使用無rnase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3. rna在裂解液sl中時不會被rnase降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。
4. 配制溶液應使用rnase-free ddh2o。(將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入depc至終濃度0.1%(vnv)，混勻后放置過夜，高壓滅菌。)
操作步驟 (僅供參考) ：
注：所有相關器皿耗材都應為rnase-free產品，操作過程要小心，帶口罩、手套避免環境中rna酶污染樣品。
1. 取試驗材料放入研缽加入液氮快速研磨成粉末狀，分裝于1.5ml新的無rnase離心管中，每管約加材料50-100mg。
2. 迅速加入600μl rna裂解液ⅰ。
3. 渦旋震蕩混勻后再加入200μl分離液和200μl去蛋白液，振蕩至混勻。
4. 冰上平放靜置5min，4℃ 12000r/min離心10min。
5. 取約700μl上清液轉入新的無rnase離心管后加入500μl rna裂解液ⅱ。
6. 振蕩混勻后冰上平放靜置5min，4℃ 12000r/min離心5min。
7. 取約700μl上清液轉入新的無rnase離心管，加350μl緩沖液，搖晃混勻，再加入350μl去蛋白液，震蕩混勻。
8. 4℃ 12000r/min離心10min。
9. 取約700μl上清液轉入新的無rnase離心管并加入等體積的提取液，溫和混勻后室溫放置10min。
10. 4 ℃ 12000r/min離心10min，小心倒掉上清。
11. 加入500μl洗滌液，4℃ 12000r/min離心1min。
12. 小心倒掉上清，風干殘留液體，加入30~50μl rnase-free ddh2o溶解沉淀。
13. 得到rna溶液并于-70 ℃保存。
rna得率：
植物樣本（100mg）
總rna量（μg）
棉花葉片
~25
擬南芥種子
~40
香蕉果肉
~5
太子參塊根
~15
rna純度及濃度檢測：
完整性: rna可用普通瓊脂糖凝膠電泳由于細胞中70-80%的rna為rrna，電泳后uv下應能看到非常明顯的rrna條帶。rrna大小分別約為5kb和2kb,分別相當于28s和18s rrna；植物rna樣品中最大rrna亮度應為次大rrna亮度的1.5-2.0倍，否則表示rna樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。
純度: od260/od280比值是衡量蛋白質污染程度的指標。高質量的rna，od260/od280讀數在1.8-2.1之間，比值為2.0是高質量rna的標志。od260/od280讀數受測定所用溶液的ph值影響。同一個rna樣品，假定在10mm tris，ph7 .5溶液中測出的od260/od280讀數1.8-2.1之間，在水溶液中所測讀數則可能在1.5-1.9之間，但這并不表示rna不純。
濃度: 取一定量的rna提取物，用rnase-free ddh2o稀釋n倍，用rnase-freeddh2o將分光光度計調零，取稀釋液進行od260，od280測定，按照以下公式進行rna濃度的計算。
終濃度(ng/μl) = (od260)× (稀釋倍數n)×40
注意事項：
1. 所有的離心步驟均在4攝氏度下進行，使用轉速可以達到13,000 rpm的傳統臺式離心機，如eppendorf 5415c或者類似離心機。
2. 需要自備研缽。
3. 裂解液ⅰ和去蛋白液中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4. 關于dna的微量殘留：
一般說來任何總rna提取試劑在提取過程中無法wan全避免dna的微量殘留 (dnase消化也無法做到10%無殘留)，本公司的 rna提取產品，由于采取了本公司du特的緩沖體系和基因組dna清除技術，絕大多數dna已經被清除，不需要dnase消化，可直接用于反轉錄pcr和熒光定量pcr。個別特殊情況如dna含量過于豐富造成殘留或者要進行嚴格的mrna表達量分析熒光定量pcr，我們建議在進行模板和引物的選擇時:
1)選用跨內含子的引物，以穿過mrna中的連接區，這樣dna就不能作為模板參與擴增反應。
2)選擇基因組dna和cdna上擴增的產物大小不一樣的引物對。
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本試劑盒采用的方法改變傳統一次性裂解的作法，對材料連續進行兩次裂解，并確保rna不被降解，有效地解離核蛋白與核酸的復合物。使用本試劑盒能在2h內完成rna的提取工作，并得到質量較高的產品，通過瓊脂糖凝膠電泳可以直觀地看到，條帶清晰，不拖尾。
本試劑盒可從植物組織(農作物、水果、花草)中，快速提取總rna，可同時處理大量不同樣品。提取的總rna純度高，基本沒有基因組、蛋白和其它雜質的污染，可用于rt-pcr、real time rt- pcr、芯片分析、northern blot、dot blot、polya篩選、體外翻譯、rnase保護分析和分子克隆等多種下游實驗。
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15ml
37.5ml
室溫
裂解液ⅱ
12ml
30ml
室溫
去蛋白液
13ml
32.5ml
室溫
緩沖液
8ml
20ml
室溫
提取液
15ml
37.5ml
室溫
分離液
5ml
12.5ml
室溫
洗滌液
12ml
30ml
室溫
rnase-free ddh2o
2ml
5ml
室溫
rnase-free離心管
80個
200個
室溫
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
儲存事項：
1. 不合適的儲存于低溫(4℃或者-20℃) 會造成溶液沉淀， 影響使用效果，因此運 輸和儲存均在室溫下(15-25℃)進行。
2. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、ph值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
預防rnase污染：
1. 經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致rnase污染。
2. 使用無rnase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3. rna在裂解液sl中時不會被rnase降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。
4. 配制溶液應使用rnase-free ddh2o。(將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入depc至終濃度0.1%(vnv)，混勻后放置過夜，高壓滅菌。)
操作步驟 (僅供參考) ：
注：所有相關器皿耗材都應為rnase-free產品，操作過程要小心，帶口罩、手套避免環境中rna酶污染樣品。
1. 取試驗材料放入研缽加入液氮快速研磨成粉末狀，分裝于1.5ml新的無rnase離心管中，每管約加材料50-100mg。
2. 迅速加入600μl rna裂解液ⅰ。
3. 渦旋震蕩混勻后再加入200μl分離液和200μl去蛋白液，振蕩至混勻。
4. 冰上平放靜置5min，4℃ 12000r/min離心10min。
5. 取約700μl上清液轉入新的無rnase離心管后加入500μl rna裂解液ⅱ。
6. 振蕩混勻后冰上平放靜置5min，4℃ 12000r/min離心5min。
7. 取約700μl上清液轉入新的無rnase離心管，加350μl緩沖液，搖晃混勻，再加入350μl去蛋白液，震蕩混勻。
8. 4℃ 12000r/min離心10min。
9. 取約700μl上清液轉入新的無rnase離心管并加入等體積的提取液，溫和混勻后室溫放置10min。
10. 4 ℃ 12000r/min離心10min，小心倒掉上清。
11. 加入500μl洗滌液，4℃ 12000r/min離心1min。
12. 小心倒掉上清，風干殘留液體，加入30~50μl rnase-free ddh2o溶解沉淀。
13. 得到rna溶液并于-70 ℃保存。
rna得率：
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總rna量（μg）
棉花葉片
~25
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~40
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~5
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~15
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完整性: rna可用普通瓊脂糖凝膠電泳由于細胞中70-80%的rna為rrna，電泳后uv下應能看到非常明顯的rrna條帶。rrna大小分別約為5kb和2kb,分別相當于28s和18s rrna；植物rna樣品中最大rrna亮度應為次大rrna亮度的1.5-2.0倍，否則表示rna樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。
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濃度: 取一定量的rna提取物，用rnase-free ddh2o稀釋n倍，用rnase-freeddh2o將分光光度計調零，取稀釋液進行od260，od280測定，按照以下公式進行rna濃度的計算。
終濃度(ng/μl) = (od260)× (稀釋倍數n)×40
注意事項：
1. 所有的離心步驟均在4攝氏度下進行，使用轉速可以達到13,000 rpm的傳統臺式離心機，如eppendorf 5415c或者類似離心機。
2. 需要自備研缽。
3. 裂解液ⅰ和去蛋白液中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4. 關于dna的微量殘留：
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1)選用跨內含子的引物，以穿過mrna中的連接區，這樣dna就不能作為模板參與擴增反應。
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