漲知識 | 酶定向進化之突變體文庫篩選技術大全
上期，我們介紹了酶定向進化的突變體文庫構建技術（點擊）。高質量的突變體文庫是定向進化的基礎，與之相匹配的是高效、靈敏的突變體篩選技術手段。根據突變體酶參與反應的場所來區分，篩選技術可分為體內和體外篩選，篩選的通量和準確度正隨著技術的不斷升級而提升。
體內篩選體內篩選是由菌株篩選衍生而來，目標酶活性與菌株生長、環境中底物代謝程度相關，性能缺陷的酶不足以支撐宿主形成單克隆，或無法使底物發生顯著變化。該方法適用于篩選與細菌生長、抗生素耐受等關鍵代謝途徑相關的酶，或可使底物發生顯著顏色變化的蛋白。不過，由于微生物可調整自身代謝流以適應環境，且存在多種補償途徑，菌株表現的優勢可能并非僅僅是目標酶的貢獻。
2011年，david liu團隊開發了pace系統（噬菌體輔助連續進化，phage-assisted continuous evolution）用于t7 rna聚合酶的馴化。pace以m13絲狀噬菌體為載體，將目標酶的活性與子代噬菌體的數量相關聯。其設計原理如圖1b所示，t7 rna聚合酶基因取代了噬菌體的衣殼蛋白基因giii，并受giii的啟動子控制，giii基因則安裝在輔助質粒上，受t7啟動子控制。重組噬菌體侵染宿主后giii啟動子開放，t7 rna聚合酶水平上升，進而介導giii蛋白大量表達，t7 rna聚合酶基因被包裝在子代噬菌體內。聚合酶活性越高，產生的活性子代噬菌體顆粒越多，相應突變體序列便隨代次增加而逐漸富集。不僅如此，pace系統還包含了誘變質粒mp（mutagenesis plasmid），多個誘變基因在l-阿拉伯糖的誘導下，介導包含目的基因在內的全基因組范圍的堿基突變。在連續流加培養體系中，基因組上積累了突變的大腸桿菌不斷被新鮮的細胞稀釋取代，用來給子代噬菌體提供優質的宿主，而攜帶突變的噬菌體持續侵染并疊加新的突變，實現目的基因的連續篩選和進化（圖1a）。利用pace系統，項目組成功地馴化了可以識別t3啟動子的t7 rna聚合酶突變體。
圖1. pace進化系統
（圖片源自：doi: 10.1038/s41596-020-00410-3.）
pace系統憑借快速、自動化的優勢被迅速推廣，適用于rna聚合酶、蛋白酶、trna合成酶等酶的進化，以及一些與dna、蛋白相互作用的蛋白質的篩選（圖1c）。同時，在giii的拮抗蛋白giii-neg的輔助下，pace系統可以更靈活地用于提升多種酶的不同性能（圖1d）。盡管如此，那些無法關聯到giii或其他噬菌體基因表達過程的蛋白依然難以用pace系統進行篩選，并且所有會導致大腸桿菌生長異常的選擇壓力都難以應用。
體外篩選不同于體內篩選，體外篩選需要用溶菌酶、超聲破碎手段或采用分泌表達策略，使目的蛋白釋放并與底物反應，借助可檢測的底物、產物量的變化或體系物理、化學性質的變化來挑選目的突變體。傳統體外篩選以試管、多孔板為培養容器，突變體酶經分離、純化、濃縮，再進行性能評價。孔板篩選的優點在于測試準確、重復性好，在高通量純化技術和全自動取樣機器人的加持下，測試通量也在不斷增加，孔板篩選可用于隨機文庫和飽和突變文庫的篩選。除了常規的試管或孔板篩選外，細胞直徑大小的油包水液滴也是將不同突變體分隔開的工具。這種策略最早在1998年被應用在甲基轉移酶的篩選測試中，每條dna分子和蛋白表達所需的緩沖液被包裹在單一的液滴內，表達后有活性的甲基轉移酶可以修飾dna使之免受內切酶的切割，確保生物素標簽被完整地保留在3’末端，進而可以被純化富集。甲基轉移酶最終在10^7的模擬文庫中脫穎而出（圖2）。
圖2. haeiii甲基轉移酶的篩選
（圖片源自：doi: org/10.1038/nbt0798-652.）
受上述系統啟發，一種為dna聚合酶量身打造的csr（compartmentalized self-replication）系統被開發。大腸桿菌取代了無細胞表達系統，負責表達聚合酶并提供dna模板，液滴內添加了pcr所需的緩沖液、dntp和引物，引物用來擴增突變體的編碼區域。高溫使細胞破碎，耐熱dna聚合酶被釋放進而完成pcr反應。dna聚合酶的活性越高，相應突變體的dna序列越多，子代文庫中包含該突變體的克隆也就越多，最終形成顯著的數量優勢（圖3）。csr已被用于taq、pfu、kod、bst等dna聚合酶，以及一些可與dna聚合酶表達關聯的蛋白（如t7 rna聚合酶、trna合成酶、trna）的進化，但它在其他酶種的進化中難以滿足需求。
圖3. 分隔自復制系統
（圖片源自：doi: 10.1073/pnas.071052198.）
酶的定向進化除了類似pace、csr這種通過積累數量實現優勢突變體富集的方法外，還可以采用突變體分選的策略。以流式分選技術為例，只要酶性能與細胞的大小、形狀、熒光強度或表面修飾狀態相關聯，當細胞流經監測口時儀器就能采集相關信號并借助電荷和磁場的作用，實現目標細胞的分選。而適用于微米級微生物分選的fads（fluorescence-activated droplet sorting）及其衍生系統（aads、bads、mads）則是另一種技術，為流式分選和液滴技術的結合。微生物細胞和底物分散在反應緩沖液中作為水相流入pdms芯片中，油相則從垂直方向進入，通過調整兩種液體的流速，水相被均勻地分割為20-50 μm大小的液滴。不同于耐熱的csr體系，液滴分選系統的細胞破碎只能依賴溶菌酶或其他化學試劑。為了防止細胞在進入液滴前裂解，溶菌試劑推薦使用再注入的方法輸入液滴，或使用替代方案先將溶菌組分與細胞混合，再將反應底物注入液滴。隨后液滴在合適條件下脫機孵育，催化反應將使液滴內的濁度、ph值、熒光信號強度、特征化合物的量發生顯著變化，超過設定閾值的液滴將在電場或氣流的作用下發生偏轉，流入收集管內（圖4）。收集的完整細胞可直接涂布培養，破碎的細胞則只能擴增回收dna用于后續實驗。
圖4. 液滴分選
（圖片源自：doi: 10.1016/j.tibs.2021.11.001.）
液滴分選系統具有以下優勢：直接檢測產物，可準確反應酶學性能的變化；皮升級的液滴反應器可大幅度節約試劑成本（~10^6倍）；最多可實現10^8/day的液滴分選；可通過設計芯片結構、調整模塊組合來適配多種酶的篩選場景。
超高通量篩選技術的出現極大地提高了酶定向進化的效率，滿足大體量突變體文庫的篩選需求。尤其是以液滴為基礎的體外篩選技術，進一步縮短了酶的迭代周期，可迅速填補特殊應用場景下酶性能的缺陷，推動現代生命科學和工業應用的發展。
針對以上介紹的不同突變體文庫篩選方法總結如下表，實際可根據不同需求選擇。
翌圣zymeeditor™酶改造定制服務
翌圣zymeeditor™是一個酶改造底層技術平臺，該平臺有四大關鍵技術：fads熒光激活微液滴分選技術，mtps微孔板篩選技術、csr分割自復制技術與計算機輔助理性設計技術，這些酶改造技術在生物醫藥、ngs建庫、ivd體外檢測等領域用酶中已得到成功應用。
圖5：zymeeditor™平臺四大關鍵技術
zymeeditor™平臺基于翌圣生物多年在分子酶改造領域中的技術積累與知識拓展，該平臺已具備對多種酶的多種需求進行定向改造的能力。因此，zymeeditor™平臺從2023年開始正式推出酶改造對外定制服務，可為各種應用領域（如醫藥、診斷、食品、化工等）的客戶提供全套酶改造服務，也可以單獨提供蛋白發酵及純化工藝開發優化、規模化生產服務，以滿足不同客戶的需求，助力產業升級。
定制服務流程
圖6：zymeeditor™酶改造定制服務流程
軸承峰值檢測技術的原理
工頻耐壓試驗裝置使用技巧及使用注意事項
調節閥振動的解決方法（8種方法）
斜管沉淀池哪些優點
無管道自凈化型通風柜的優勢
漲知識 | 酶定向進化之突變體文庫篩選技術大全
JKS堿骨料試驗箱使用說明
米頓羅MiltonRoy加藥泵的工作原理及使用注意事項
德國SIKA流量開關產品特征
大氣環境監測系統：打造健康、宜居的生態環境
金相顯微鏡的特點及一般維護、保養（下）
涼意漸濃寒露至，清秋無恙愿君安
灌裝機質量很重要！
鄭州：打造中國智能傳感谷 加快新一代信息技術產業發展
甘油三酯（TG）干擾物質使用方法
PM632 3BSE005831R1備件
灌砂法密度試驗儀鵬翼廠家
E+H壓力變送器如何選型
869186-83-4，N3-半乳糖是一種生物學功能的糖類
淺析耐高溫化工泵的工作機理
體內篩選體內篩選是由菌株篩選衍生而來，目標酶活性與菌株生長、環境中底物代謝程度相關，性能缺陷的酶不足以支撐宿主形成單克隆，或無法使底物發生顯著變化。該方法適用于篩選與細菌生長、抗生素耐受等關鍵代謝途徑相關的酶，或可使底物發生顯著顏色變化的蛋白。不過，由于微生物可調整自身代謝流以適應環境，且存在多種補償途徑，菌株表現的優勢可能并非僅僅是目標酶的貢獻。
2011年，david liu團隊開發了pace系統（噬菌體輔助連續進化，phage-assisted continuous evolution）用于t7 rna聚合酶的馴化。pace以m13絲狀噬菌體為載體，將目標酶的活性與子代噬菌體的數量相關聯。其設計原理如圖1b所示，t7 rna聚合酶基因取代了噬菌體的衣殼蛋白基因giii，并受giii的啟動子控制，giii基因則安裝在輔助質粒上，受t7啟動子控制。重組噬菌體侵染宿主后giii啟動子開放，t7 rna聚合酶水平上升，進而介導giii蛋白大量表達，t7 rna聚合酶基因被包裝在子代噬菌體內。聚合酶活性越高，產生的活性子代噬菌體顆粒越多，相應突變體序列便隨代次增加而逐漸富集。不僅如此，pace系統還包含了誘變質粒mp（mutagenesis plasmid），多個誘變基因在l-阿拉伯糖的誘導下，介導包含目的基因在內的全基因組范圍的堿基突變。在連續流加培養體系中，基因組上積累了突變的大腸桿菌不斷被新鮮的細胞稀釋取代，用來給子代噬菌體提供優質的宿主，而攜帶突變的噬菌體持續侵染并疊加新的突變，實現目的基因的連續篩選和進化（圖1a）。利用pace系統，項目組成功地馴化了可以識別t3啟動子的t7 rna聚合酶突變體。
圖1. pace進化系統
（圖片源自：doi: 10.1038/s41596-020-00410-3.）
pace系統憑借快速、自動化的優勢被迅速推廣，適用于rna聚合酶、蛋白酶、trna合成酶等酶的進化，以及一些與dna、蛋白相互作用的蛋白質的篩選（圖1c）。同時，在giii的拮抗蛋白giii-neg的輔助下，pace系統可以更靈活地用于提升多種酶的不同性能（圖1d）。盡管如此，那些無法關聯到giii或其他噬菌體基因表達過程的蛋白依然難以用pace系統進行篩選，并且所有會導致大腸桿菌生長異常的選擇壓力都難以應用。
體外篩選不同于體內篩選，體外篩選需要用溶菌酶、超聲破碎手段或采用分泌表達策略，使目的蛋白釋放并與底物反應，借助可檢測的底物、產物量的變化或體系物理、化學性質的變化來挑選目的突變體。傳統體外篩選以試管、多孔板為培養容器，突變體酶經分離、純化、濃縮，再進行性能評價。孔板篩選的優點在于測試準確、重復性好，在高通量純化技術和全自動取樣機器人的加持下，測試通量也在不斷增加，孔板篩選可用于隨機文庫和飽和突變文庫的篩選。除了常規的試管或孔板篩選外，細胞直徑大小的油包水液滴也是將不同突變體分隔開的工具。這種策略最早在1998年被應用在甲基轉移酶的篩選測試中，每條dna分子和蛋白表達所需的緩沖液被包裹在單一的液滴內，表達后有活性的甲基轉移酶可以修飾dna使之免受內切酶的切割，確保生物素標簽被完整地保留在3’末端，進而可以被純化富集。甲基轉移酶最終在10^7的模擬文庫中脫穎而出（圖2）。
圖2. haeiii甲基轉移酶的篩選
（圖片源自：doi: org/10.1038/nbt0798-652.）
受上述系統啟發，一種為dna聚合酶量身打造的csr（compartmentalized self-replication）系統被開發。大腸桿菌取代了無細胞表達系統，負責表達聚合酶并提供dna模板，液滴內添加了pcr所需的緩沖液、dntp和引物，引物用來擴增突變體的編碼區域。高溫使細胞破碎，耐熱dna聚合酶被釋放進而完成pcr反應。dna聚合酶的活性越高，相應突變體的dna序列越多，子代文庫中包含該突變體的克隆也就越多，最終形成顯著的數量優勢（圖3）。csr已被用于taq、pfu、kod、bst等dna聚合酶，以及一些可與dna聚合酶表達關聯的蛋白（如t7 rna聚合酶、trna合成酶、trna）的進化，但它在其他酶種的進化中難以滿足需求。
圖3. 分隔自復制系統
（圖片源自：doi: 10.1073/pnas.071052198.）
酶的定向進化除了類似pace、csr這種通過積累數量實現優勢突變體富集的方法外，還可以采用突變體分選的策略。以流式分選技術為例，只要酶性能與細胞的大小、形狀、熒光強度或表面修飾狀態相關聯，當細胞流經監測口時儀器就能采集相關信號并借助電荷和磁場的作用，實現目標細胞的分選。而適用于微米級微生物分選的fads（fluorescence-activated droplet sorting）及其衍生系統（aads、bads、mads）則是另一種技術，為流式分選和液滴技術的結合。微生物細胞和底物分散在反應緩沖液中作為水相流入pdms芯片中，油相則從垂直方向進入，通過調整兩種液體的流速，水相被均勻地分割為20-50 μm大小的液滴。不同于耐熱的csr體系，液滴分選系統的細胞破碎只能依賴溶菌酶或其他化學試劑。為了防止細胞在進入液滴前裂解，溶菌試劑推薦使用再注入的方法輸入液滴，或使用替代方案先將溶菌組分與細胞混合，再將反應底物注入液滴。隨后液滴在合適條件下脫機孵育，催化反應將使液滴內的濁度、ph值、熒光信號強度、特征化合物的量發生顯著變化，超過設定閾值的液滴將在電場或氣流的作用下發生偏轉，流入收集管內（圖4）。收集的完整細胞可直接涂布培養，破碎的細胞則只能擴增回收dna用于后續實驗。
圖4. 液滴分選
（圖片源自：doi: 10.1016/j.tibs.2021.11.001.）
液滴分選系統具有以下優勢：直接檢測產物，可準確反應酶學性能的變化；皮升級的液滴反應器可大幅度節約試劑成本（~10^6倍）；最多可實現10^8/day的液滴分選；可通過設計芯片結構、調整模塊組合來適配多種酶的篩選場景。
超高通量篩選技術的出現極大地提高了酶定向進化的效率，滿足大體量突變體文庫的篩選需求。尤其是以液滴為基礎的體外篩選技術，進一步縮短了酶的迭代周期，可迅速填補特殊應用場景下酶性能的缺陷，推動現代生命科學和工業應用的發展。
針對以上介紹的不同突變體文庫篩選方法總結如下表，實際可根據不同需求選擇。
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翌圣zymeeditor™是一個酶改造底層技術平臺，該平臺有四大關鍵技術：fads熒光激活微液滴分選技術，mtps微孔板篩選技術、csr分割自復制技術與計算機輔助理性設計技術，這些酶改造技術在生物醫藥、ngs建庫、ivd體外檢測等領域用酶中已得到成功應用。
圖5：zymeeditor™平臺四大關鍵技術
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定制服務流程
圖6：zymeeditor™酶改造定制服務流程
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869186-83-4，N3-半乳糖是一種生物學功能的糖類
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