細胞攻略 | NK-92MI(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞)培養教程
--細 胞 基 本 信 息---
細胞名稱： nk-92mi(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者nk細胞)
細胞別稱： nk-92mi mi; nk-92mi mi; nk92-mi; nk92mi; nk-92mi transfected with mfg-hil2
細胞貨號： snl-195
生長特性： 懸浮
培養條件： 1640+10% fbs+1% p/s
培養環境： 空氣，95%； 二氧化碳 (co2)，5%；37℃
細胞簡介： nk-92細胞是從一位患有急進性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細胞衍生來的一株il-2依賴型nk細胞株。nk-92mi細胞是轉染得到的源自nk-92細胞的il-2非依賴的nk細胞株，親本細胞nk-92通過微粒體基因轉化法用逆轉錄病毒mfg-hil-2載體攜帶的人il-2cdna進行轉化，可能由于載體整合到基因組dna中，轉化是穩定的。nk-92mi細胞細胞對很多惡性細胞有細胞毒性；鉻釋放試驗顯示它能殺死k562細胞和daudi細胞。nk-92細胞有以下特征：cd2、cd7、cd11a、cd28、cd45、cd54表面標記陽性；cd1、cd3、cd4、cd5、cd8、cd10、cd14、cd16、cd19、cd20、cd23、cd34和hla-dr表面標記陰性。nk-92mi細胞和nk-92ci細胞這兩個變種都包含、表達并合成hil-2cdna。nk-92mi細胞合成的il-2水平比nk-92ci高，而親本細胞不合成表達。1998年9月提交到atcc的培養物污染了支原體，其后代通過bm細胞周期蛋白處理21天消除支原體，處理后6周，用hoechst染色、pcr和標準培養測試進行支原體檢測，結果都呈陰性。
細胞正常生長形態照片
nk-92mi細胞培養注意事項
lnk-92mi細胞呈聚團懸浮生長，細胞團較大時需要吹打成小團，防止團塊中間的細胞因營養不足而死亡。除非實驗需要，不建議經常將細胞吹散成單個細胞，否則細胞狀態將變差；
lnk-92mi細胞對血清要求高，應該使用優質血清進行培養；
lnk-92mi細胞對吹打等機械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度輕柔；
lnk-92mi細胞對溫度敏感，培養基、pbs需復溫至37℃再使用。
lnk-92mi細胞凍存難度較大，建議使用90% fbs+10%dmso凍存液，凍存密度推薦300萬細胞/毫升，不能過低。凍存時細胞應吹散成單細胞。
l復蘇時建議將血清濃度提高至20%，待細胞可以正常聚集生長后再將血清濃度恢復至10%
lnk-92mi細胞計數時算得的細胞的活率不能代表該細胞真實的狀態。因為培養時存在一些散在的單細胞，這些細胞活性較低，且不能完*去除，導致在計數時細胞整體活率可能不高。細胞狀態可以通過細胞能否聚團判斷：只要大部分細胞能聚團生長，細胞狀態就沒有問題。當細胞狀態不佳時，細胞無法順利聚團。
l當細胞狀態不佳時，向培養基中按100-200u/ml補充il-2，可有效改善。
nk-92mi細胞換液方法
l半換液法：
1.準備所需的培養基、離心管以及無菌槍頭等；（培養基提前預熱）
2.將培養瓶豎立靜置一段時間，待細胞沉底；（肉眼觀察細胞沉底情況）
3.吸頭緊貼液面，小心吸出一半的培養基，轉移到離心管；
4.900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細胞，則用新鮮培養基重懸后放回原瓶；
5.原瓶補充一半的新鮮培養基。
tips：建議半換液2-3次后進行離心換液。
l離心換液法：
1.準備所需的培養基、離心管以及無菌槍頭等；（培養基提前預熱）
2.將所有細胞懸液轉移至離心管中；
3.900-1000rpm，3min離心；
4.棄上清，加5ml pbs輕輕重懸細胞進行潤洗，再900-1000rpm，3min離心；
tips：此處pbs潤洗是為了去除細胞碎片，平時培養若細胞碎片不多可以忽略此步驟。
5.培養瓶中加入適量新鮮培養基；
6.離心完成后棄上清，加適量新鮮培養基輕輕重懸細胞沉淀，將細胞懸液接種回培養瓶中，混勻細胞，放入培養箱中繼續培養。
nk-92mi細胞傳代方法
l離心法：
1.準備所需的培養基、離心管以及無菌槍頭等；（培養基提前預熱）
2.用移液器吸取培養瓶內細胞懸液轉移至離心管中；
3.900-1000rpm，3min離心收集細胞；
4.在培養瓶中加入適量新鮮培養基；（t25推薦10ml，t75推薦20ml）
5.離心完成后，棄離心管內上清，然后加入適量新鮮培養基，輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養瓶中，輕輕混勻后將細胞放入培養箱中繼續培養。
l直接分瓶法：
1.輕輕搖晃培養瓶，使細胞均勻分散；若有較大的細胞團，需吹散成小團。
2.用移液器吸取培養瓶內細胞懸液，均分到若干個新培養瓶中，每瓶再補充適量的新鮮培養基，輕輕混勻后將細胞放入培養箱中繼續培養。
tips：
l注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉速以及時間不要過高，避免細胞受機械損傷。
l傳代比例推薦1：2
nk-92mi細胞凍存方法
1.準備所需的培養基、pbs、血清、dmso、離心管以及無菌槍頭等；（試劑需提前預熱）
tips：若凍存前培養基已經變黃，先換液靜置培養4h左右，待細胞活力穩定后再進行凍存。
2.根據收集到細胞量，配制相應量的凍存液，并準備相應數量的凍存管，在凍存管上標志細胞名稱，代次，凍存時間等信息。推薦凍存液配方：90%fbs+10%dmso；凍存密度300萬細胞/ml/管。
tips：凍存密度過低將導致復蘇后狀態不佳。
3.將細胞懸液轉移至離心管中1000rpm，3min離心收集細胞；
4.離心完成后棄上清，加入相應量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細胞，將細胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度，不要產生過多氣泡；
tips：加入凍存液混勻細胞后及時分裝并將細胞降溫凍存，以減少dmso對細胞的毒性。
5.將細胞放置程序降溫凍存盒中，再將凍存盒轉移至-80℃冰箱進行降溫凍存。
6.次日（16h-24h后）復蘇一管檢查凍存效果，確認沒問題后及時將凍存細胞放置液氮中保存，細胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。
nk-92mi細胞復蘇方法
1.提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；
2.將凍存細胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速搖晃至完*融化，融化時間不超過2min；
tips：
l若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。
l水浴時使用一次性pe手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。
3.直接將凍存管900-1000rpm 2min離心，同時在培養瓶中加入適量新鮮培養基；
4.離心完成后棄上清，吸取1ml新鮮培養基（建議血清濃度提高至20%）輕輕重懸細胞，吹散細胞后接種到培養瓶中；
5.使用十字法或8字法將細胞混勻后置于培養箱中培養。
tips：整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。
nk-92mi細胞收貨攻略
1.拆封包裝盒，確認細胞，說明書等是否齊全，收貨細胞名與所購買細胞是否符合；
2.觀察細胞培養瓶是否完好，有無漏液，培養瓶內培養基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等，發現異常及時拍照聯系銷售人員；
3.確認無異常后，將培養瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養箱平衡4h左右，讓懸浮細胞沉下培養瓶底部；
4.平衡過程中可以仔細閱讀細胞說明書，知悉細胞所需培養體系，培養環境以及培養注意事項等；
5.平衡完成后豎立取出細胞培養瓶，此時大部分細胞沉在培養瓶底部，小心吸取上清至離心管中，保留10ml左右培養基在培養瓶內，小心操作，盡量不要吸到沉在底部的細胞；
6.將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養瓶底部的細胞，上清可以4℃保存，后續用于培養細胞，以平穩過度到自己的培養基。將收集到的細胞接種至原培養瓶；
7.觀察細胞，根據細胞狀態，以及團塊數量、大小決定傳代或繼續培養。
常見問題及解決方案
培養過程中細胞碎片較多怎么處理？
1.細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。
2.細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可通過900-1000rpm，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細胞生長，不建議頻繁離心。
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細胞貨號： snl-195
生長特性： 懸浮
培養條件： 1640+10% fbs+1% p/s
培養環境： 空氣，95%； 二氧化碳 (co2)，5%；37℃
細胞簡介： nk-92細胞是從一位患有急進性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細胞衍生來的一株il-2依賴型nk細胞株。nk-92mi細胞是轉染得到的源自nk-92細胞的il-2非依賴的nk細胞株，親本細胞nk-92通過微粒體基因轉化法用逆轉錄病毒mfg-hil-2載體攜帶的人il-2cdna進行轉化，可能由于載體整合到基因組dna中，轉化是穩定的。nk-92mi細胞細胞對很多惡性細胞有細胞毒性；鉻釋放試驗顯示它能殺死k562細胞和daudi細胞。nk-92細胞有以下特征：cd2、cd7、cd11a、cd28、cd45、cd54表面標記陽性；cd1、cd3、cd4、cd5、cd8、cd10、cd14、cd16、cd19、cd20、cd23、cd34和hla-dr表面標記陰性。nk-92mi細胞和nk-92ci細胞這兩個變種都包含、表達并合成hil-2cdna。nk-92mi細胞合成的il-2水平比nk-92ci高，而親本細胞不合成表達。1998年9月提交到atcc的培養物污染了支原體，其后代通過bm細胞周期蛋白處理21天消除支原體，處理后6周，用hoechst染色、pcr和標準培養測試進行支原體檢測，結果都呈陰性。
細胞正常生長形態照片
nk-92mi細胞培養注意事項
lnk-92mi細胞呈聚團懸浮生長，細胞團較大時需要吹打成小團，防止團塊中間的細胞因營養不足而死亡。除非實驗需要，不建議經常將細胞吹散成單個細胞，否則細胞狀態將變差；
lnk-92mi細胞對血清要求高，應該使用優質血清進行培養；
lnk-92mi細胞對吹打等機械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度輕柔；
lnk-92mi細胞對溫度敏感，培養基、pbs需復溫至37℃再使用。
lnk-92mi細胞凍存難度較大，建議使用90% fbs+10%dmso凍存液，凍存密度推薦300萬細胞/毫升，不能過低。凍存時細胞應吹散成單細胞。
l復蘇時建議將血清濃度提高至20%，待細胞可以正常聚集生長后再將血清濃度恢復至10%
lnk-92mi細胞計數時算得的細胞的活率不能代表該細胞真實的狀態。因為培養時存在一些散在的單細胞，這些細胞活性較低，且不能完*去除，導致在計數時細胞整體活率可能不高。細胞狀態可以通過細胞能否聚團判斷：只要大部分細胞能聚團生長，細胞狀態就沒有問題。當細胞狀態不佳時，細胞無法順利聚團。
l當細胞狀態不佳時，向培養基中按100-200u/ml補充il-2，可有效改善。
nk-92mi細胞換液方法
l半換液法：
1.準備所需的培養基、離心管以及無菌槍頭等；（培養基提前預熱）
2.將培養瓶豎立靜置一段時間，待細胞沉底；（肉眼觀察細胞沉底情況）
3.吸頭緊貼液面，小心吸出一半的培養基，轉移到離心管；
4.900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細胞，則用新鮮培養基重懸后放回原瓶；
5.原瓶補充一半的新鮮培養基。
tips：建議半換液2-3次后進行離心換液。
l離心換液法：
1.準備所需的培養基、離心管以及無菌槍頭等；（培養基提前預熱）
2.將所有細胞懸液轉移至離心管中；
3.900-1000rpm，3min離心；
4.棄上清，加5ml pbs輕輕重懸細胞進行潤洗，再900-1000rpm，3min離心；
tips：此處pbs潤洗是為了去除細胞碎片，平時培養若細胞碎片不多可以忽略此步驟。
5.培養瓶中加入適量新鮮培養基；
6.離心完成后棄上清，加適量新鮮培養基輕輕重懸細胞沉淀，將細胞懸液接種回培養瓶中，混勻細胞，放入培養箱中繼續培養。
nk-92mi細胞傳代方法
l離心法：
1.準備所需的培養基、離心管以及無菌槍頭等；（培養基提前預熱）
2.用移液器吸取培養瓶內細胞懸液轉移至離心管中；
3.900-1000rpm，3min離心收集細胞；
4.在培養瓶中加入適量新鮮培養基；（t25推薦10ml，t75推薦20ml）
5.離心完成后，棄離心管內上清，然后加入適量新鮮培養基，輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養瓶中，輕輕混勻后將細胞放入培養箱中繼續培養。
l直接分瓶法：
1.輕輕搖晃培養瓶，使細胞均勻分散；若有較大的細胞團，需吹散成小團。
2.用移液器吸取培養瓶內細胞懸液，均分到若干個新培養瓶中，每瓶再補充適量的新鮮培養基，輕輕混勻后將細胞放入培養箱中繼續培養。
tips：
l注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉速以及時間不要過高，避免細胞受機械損傷。
l傳代比例推薦1：2
nk-92mi細胞凍存方法
1.準備所需的培養基、pbs、血清、dmso、離心管以及無菌槍頭等；（試劑需提前預熱）
tips：若凍存前培養基已經變黃，先換液靜置培養4h左右，待細胞活力穩定后再進行凍存。
2.根據收集到細胞量，配制相應量的凍存液，并準備相應數量的凍存管，在凍存管上標志細胞名稱，代次，凍存時間等信息。推薦凍存液配方：90%fbs+10%dmso；凍存密度300萬細胞/ml/管。
tips：凍存密度過低將導致復蘇后狀態不佳。
3.將細胞懸液轉移至離心管中1000rpm，3min離心收集細胞；
4.離心完成后棄上清，加入相應量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細胞，將細胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度，不要產生過多氣泡；
tips：加入凍存液混勻細胞后及時分裝并將細胞降溫凍存，以減少dmso對細胞的毒性。
5.將細胞放置程序降溫凍存盒中，再將凍存盒轉移至-80℃冰箱進行降溫凍存。
6.次日（16h-24h后）復蘇一管檢查凍存效果，確認沒問題后及時將凍存細胞放置液氮中保存，細胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。
nk-92mi細胞復蘇方法
1.提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；
2.將凍存細胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速搖晃至完*融化，融化時間不超過2min；
tips：
l若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。
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3.直接將凍存管900-1000rpm 2min離心，同時在培養瓶中加入適量新鮮培養基；
4.離心完成后棄上清，吸取1ml新鮮培養基（建議血清濃度提高至20%）輕輕重懸細胞，吹散細胞后接種到培養瓶中；
5.使用十字法或8字法將細胞混勻后置于培養箱中培養。
tips：整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。
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1.拆封包裝盒，確認細胞，說明書等是否齊全，收貨細胞名與所購買細胞是否符合；
2.觀察細胞培養瓶是否完好，有無漏液，培養瓶內培養基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等，發現異常及時拍照聯系銷售人員；
3.確認無異常后，將培養瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養箱平衡4h左右，讓懸浮細胞沉下培養瓶底部；
4.平衡過程中可以仔細閱讀細胞說明書，知悉細胞所需培養體系，培養環境以及培養注意事項等；
5.平衡完成后豎立取出細胞培養瓶，此時大部分細胞沉在培養瓶底部，小心吸取上清至離心管中，保留10ml左右培養基在培養瓶內，小心操作，盡量不要吸到沉在底部的細胞；
6.將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養瓶底部的細胞，上清可以4℃保存，后續用于培養細胞，以平穩過度到自己的培養基。將收集到的細胞接種至原培養瓶；
7.觀察細胞，根據細胞狀態，以及團塊數量、大小決定傳代或繼續培養。
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1.細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。
2.細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可通過900-1000rpm，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細胞生長，不建議頻繁離心。
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