SN/T 4519-2016 出口動物源食品中利巴韋林殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法
中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準
sn/t 4519-2016
出口動物源食品中利巴韋林殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法
determination of ribavirin residue in foodstuffs of animal origin for export-lc-ms/ms method
1范圍
本標準規定了動物源食品中利巴韋林殘留量的液相色譜質譜/質譜的測定方法。
本標準適用于雞肉、肝臟、腎、蛋豬肉、鰻魚、蝦等動物源食品中利巴韋林殘留量的測定和確證。
2規范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規格和試驗方法
3方法提要
試樣中殘留的利巴韋林代謝物經酸性磷酸酯酶水解成利巴韋林原藥，與樣品中殘留的利巴韋林原藥一起，經三氯乙酸-乙腈混合溶液提取，經苯硼酸固相萃取小柱凈化，液相色譜質譜/質譜進行測定，同位素內標法定量。
4試劑和材料
除非另有說明，所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規定的一級水。
4.1甲醇：色譜純。
4.2乙腈：色譜純。
4.3甲酸：色譜純。
4.4三氯乙酸。
4.5氨水：含量為25%~28%。
4.6乙酸銨：色譜級純。
4.7酸性磷酸酯酶（phosphatase acid，from wheat germ，活力：≥0.4 unit/mg，cas號：9001-77-8）。
4.8酸性磷酸酯酶溶液（100μg/ml）：準確稱取酸性磷酸酯酶（4.7）5 mg，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成100μg/ml的酶解液，4℃~8℃冰箱中保存。
4.9三氯乙酸溶液（20 g/l，ph 4.8）：稱取20 g三氯乙酸，加水約950 ml使其溶解，用氨水調ph至4.8（±0.1），再加水定容至1 000 ml。
4.10 pba苯硼酸固相萃取小柱洗脫液，甲酸-水-甲醇溶液（體積比2：8：90）：準確量取2 ml甲酸和8ml水加入90ml的甲醇中，混勻后備用。
4.11乙酸銨緩沖溶液（2.0 mol/l，ph 4.8）：稱取乙酸銨77.0 g，加水約450 ml使其溶解，用乙酸調ph至4.8（±0.1），再加水定溶至500 ml。
4.12乙酸銨緩沖溶液（0.25 mol/l，ph 8.5）：稱取乙酸銨9.06 g，加水約450 ml使其溶解，用氨水調ph至8.5（±0.1），再加水定容至500 ml。
4.13標準物質：利巴韋林（ribavirin；cas號：36791-04-5），純度大于98.0%。
4.14同位素內標標準物質：利巴韋林-13c5純度大于99.0%。
4.15標準儲備液（100μg/ml）：準確稱取利巴韋林標準品（4.13）10 mg（精確至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成100μg/ml的標準儲備液，-18℃冰箱中保存，有效期為1年。
4.16標準中間液（1.0μg/ml）：用移液管吸取標準儲備液（4.15）1 ml置100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻得到1.0μg/ml標準中間液，置4℃~8℃冰箱中保存，有效期為3個月。
4.17內標儲備液：準確稱取利巴韋林-13c5標準品（4.14）10 mg（精確至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1 00μg/ml的內標標準儲備液，-18℃冰箱中保存，有效期為1年。
4.18內標中間溶液（1.0μg/ml）：移取1.00 ml的內標標準儲備液（4.17）至100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，置4℃~8℃冰箱中保存，有效期為3個月。
4.19標準工作液：臨用時根據需要，移取適量的標準中間溶液（4.16）和內標中間溶液（4.18），用乙腈稀釋至合適濃度，使用前配制。
4.20pba苯硼酸固相萃取小柱：100 mg/3 ml，或相當者；使用前依次用3 ml乙腈，3 ml乙腈-1%甲酸（體積比，3：1），3ml乙酸銨緩沖溶液（4.12）活化，并保持柱體濕潤。
4.21濾膜：0.22μm，有機系。
5儀器和設備
5.1液相色譜-質譜/質譜儀：配電噴霧電離（esi）源。
5.2天平：感量0.1 mg和0.01 g。
5.3組織搗碎機。
5.4高速冷凍離心機：轉速≥8 000 r/ min。
5.5離心機：5 000 r/min。
5.6漩渦振蕩器。
5.7 ph計。
5.8氮吹儀。
5.9固相萃取裝置。
6試樣制備與保存
6.1試樣制備
肌肉、肝臟、腎放入組織搗碎機均質，充分混勻，均分成兩份，分別裝入清潔容器內，并標明標記；蛋類，蝦去殼后取可食部分后放入組織搗碎機均質，充分混勻，均分成兩份，分別裝入清潔容器內，并標明標記。
制樣操作過程中，應防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。
6.2試樣保存
試樣于-18℃以下保存，新鮮或冷凍的組織樣品可在2℃~6℃貯存72 h。
7測定步驟
7.1提取
稱取約5g（精確至0.01g）試樣，置于50ml具螺旋蓋的聚丙烯離心管中，添加100μl內標標準工作溶液（0.1μg/ml），加入12 ml三氯乙酸溶液（4.9）和2.5 ml乙腈，振蕩混勻3.0 min后在超聲波發生器中超聲10 min，于15 000 r/min離心5 min，取出上清液，再加入10 ml三氯乙酸溶液（4.9）重復提取一次，離心后合并上清液定容至25 ml的容量瓶中。
7.2酶解
準確移取5 ml以上提取液，加入1.0 ml乙酸銨溶液（4.11），混勻，再加入100μl酸性磷酸酯酶（4.8），加蓋后渦旋1 min，于恒溫烘箱中37℃培養2h。取出后冷卻至室溫，用氨水調ph至8.5（±0.1），混勻，4 000 r/min離心5 min，取上清液備用。
7.3凈化
取上清液（7.2），上樣到活化過的pba固相萃取小柱，控制上樣流速小于3 ml/min；依次用5 ml含有10%乙腈-乙酸銨緩沖溶液（4.12）和2.0 ml 5%氨水甲醇林洗，然后真空抽干5 min，以4.0 ml洗脫溶液（4.10）洗脫至10 ml玻璃管中，在45℃用氮氣濃縮儀吹干。準確加入1.0 ml乙腈水（體積比90：10）溶液溶解殘渣，過0.22μm濾膜，供液相色譜質譜/質譜儀測定。
7.4測定
7.4.1液相色譜條件
7.4.1.1色譜柱：兩性離子型親水相互作用色譜柱，100mm×3.0 mm（內徑），粒度2.7μm，或相當者。
7.4.1.2流動相：a為5 mmol/l乙酸銨溶液（含0.2%甲酸），b為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1液相色譜的梯度洗脫程序
時間/min
流動相/a%
流動相/b%
0
5
95
2
5
95
4
30
70
5
60
40
6
5
95
10
5
95
7.4.1.3流速：0.4 ml/ min。
7.4.1.4柱溫：30℃。
7.4.1.5進樣量：2μl。
7.4.2質譜條件
7.4.2.1離子化模式：電噴霧電離（esi）正離子模式；
7.4.2.2質譜掃描方式：多反應監測（mrm）；
7.4.2.3其他參考質譜條件參見附錄a。
被測組分選擇1個母離子，2個以上子離子，在相同實驗條件下，樣品中待測物質的保留時間與標準校準溶液中對應濃度標準校準溶液的保留時間偏差在±2.5%之內；且樣品譜圖中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的標準校準溶液譜圖中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過表2規定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。
7.4.4定量測定
內標法定量：用標準工作溶液分別進樣，以分析化合物和內標化合物的峰面積比為縱坐標，以分析化合物和內標化合物的濃度比為橫坐標作標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，標準工作液和待測液中利巴韋林的響應值均應在儀器線性響應范圍內。利巴韋林的保留時間、母離子和子離子參見附錄a表a.1。利巴韋林的標準品選擇離子流色譜圖參見附錄b圖b.1。
7.5空白試驗
除不加試樣外，均按7.1~7.4操作步驟進行。
8結果計算和表述
試樣中利巴韋林的殘留總量利用數據處理系統計算或按式（1）計算，計算結果需扣除空白值。
式中：
x——樣品中利巴韋林殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；
c——標準工作溶液中利巴韋林的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
ci——樣液中內標物的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
a——樣液中利巴韋林的峰面積；
asi——標準工作溶液中內標物的峰面積；
v——樣品溶液最終定容體積，單位為毫升（ml）；
csi——標準工作溶液中內標物的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
ai——樣液中內標物的峰面積；
as——標準工作溶液中利巴韋林的峰面積；
m——最終樣液代表的試樣質量，單位為克（g）。
9測定低限和回收率
9.1測定低限
本方法中利巴韋林的測定低限為1.0μg/kg。
9.2正確度（回收率）
不同基質中利巴韋林殘留量在不同添加水平下的回收率試驗數據參見附錄c表c.1。
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如何選擇合適的橡膠拉伸強度試驗機，韌恒橡膠檢測設備
一起了解下保安過濾器
自吸泵吸不上來水的原因及解決辦法
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出口動物源食品中利巴韋林殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法
determination of ribavirin residue in foodstuffs of animal origin for export-lc-ms/ms method
1范圍
本標準規定了動物源食品中利巴韋林殘留量的液相色譜質譜/質譜的測定方法。
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2規范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
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3方法提要
試樣中殘留的利巴韋林代謝物經酸性磷酸酯酶水解成利巴韋林原藥，與樣品中殘留的利巴韋林原藥一起，經三氯乙酸-乙腈混合溶液提取，經苯硼酸固相萃取小柱凈化，液相色譜質譜/質譜進行測定，同位素內標法定量。
4試劑和材料
除非另有說明，所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規定的一級水。
4.1甲醇：色譜純。
4.2乙腈：色譜純。
4.3甲酸：色譜純。
4.4三氯乙酸。
4.5氨水：含量為25%~28%。
4.6乙酸銨：色譜級純。
4.7酸性磷酸酯酶（phosphatase acid，from wheat germ，活力：≥0.4 unit/mg，cas號：9001-77-8）。
4.8酸性磷酸酯酶溶液（100μg/ml）：準確稱取酸性磷酸酯酶（4.7）5 mg，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成100μg/ml的酶解液，4℃~8℃冰箱中保存。
4.9三氯乙酸溶液（20 g/l，ph 4.8）：稱取20 g三氯乙酸，加水約950 ml使其溶解，用氨水調ph至4.8（±0.1），再加水定容至1 000 ml。
4.10 pba苯硼酸固相萃取小柱洗脫液，甲酸-水-甲醇溶液（體積比2：8：90）：準確量取2 ml甲酸和8ml水加入90ml的甲醇中，混勻后備用。
4.11乙酸銨緩沖溶液（2.0 mol/l，ph 4.8）：稱取乙酸銨77.0 g，加水約450 ml使其溶解，用乙酸調ph至4.8（±0.1），再加水定溶至500 ml。
4.12乙酸銨緩沖溶液（0.25 mol/l，ph 8.5）：稱取乙酸銨9.06 g，加水約450 ml使其溶解，用氨水調ph至8.5（±0.1），再加水定容至500 ml。
4.13標準物質：利巴韋林（ribavirin；cas號：36791-04-5），純度大于98.0%。
4.14同位素內標標準物質：利巴韋林-13c5純度大于99.0%。
4.15標準儲備液（100μg/ml）：準確稱取利巴韋林標準品（4.13）10 mg（精確至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成100μg/ml的標準儲備液，-18℃冰箱中保存，有效期為1年。
4.16標準中間液（1.0μg/ml）：用移液管吸取標準儲備液（4.15）1 ml置100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻得到1.0μg/ml標準中間液，置4℃~8℃冰箱中保存，有效期為3個月。
4.17內標儲備液：準確稱取利巴韋林-13c5標準品（4.14）10 mg（精確至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1 00μg/ml的內標標準儲備液，-18℃冰箱中保存，有效期為1年。
4.18內標中間溶液（1.0μg/ml）：移取1.00 ml的內標標準儲備液（4.17）至100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，置4℃~8℃冰箱中保存，有效期為3個月。
4.19標準工作液：臨用時根據需要，移取適量的標準中間溶液（4.16）和內標中間溶液（4.18），用乙腈稀釋至合適濃度，使用前配制。
4.20pba苯硼酸固相萃取小柱：100 mg/3 ml，或相當者；使用前依次用3 ml乙腈，3 ml乙腈-1%甲酸（體積比，3：1），3ml乙酸銨緩沖溶液（4.12）活化，并保持柱體濕潤。
4.21濾膜：0.22μm，有機系。
5儀器和設備
5.1液相色譜-質譜/質譜儀：配電噴霧電離（esi）源。
5.2天平：感量0.1 mg和0.01 g。
5.3組織搗碎機。
5.4高速冷凍離心機：轉速≥8 000 r/ min。
5.5離心機：5 000 r/min。
5.6漩渦振蕩器。
5.7 ph計。
5.8氮吹儀。
5.9固相萃取裝置。
6試樣制備與保存
6.1試樣制備
肌肉、肝臟、腎放入組織搗碎機均質，充分混勻，均分成兩份，分別裝入清潔容器內，并標明標記；蛋類，蝦去殼后取可食部分后放入組織搗碎機均質，充分混勻，均分成兩份，分別裝入清潔容器內，并標明標記。
制樣操作過程中，應防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。
6.2試樣保存
試樣于-18℃以下保存，新鮮或冷凍的組織樣品可在2℃~6℃貯存72 h。
7測定步驟
7.1提取
稱取約5g（精確至0.01g）試樣，置于50ml具螺旋蓋的聚丙烯離心管中，添加100μl內標標準工作溶液（0.1μg/ml），加入12 ml三氯乙酸溶液（4.9）和2.5 ml乙腈，振蕩混勻3.0 min后在超聲波發生器中超聲10 min，于15 000 r/min離心5 min，取出上清液，再加入10 ml三氯乙酸溶液（4.9）重復提取一次，離心后合并上清液定容至25 ml的容量瓶中。
7.2酶解
準確移取5 ml以上提取液，加入1.0 ml乙酸銨溶液（4.11），混勻，再加入100μl酸性磷酸酯酶（4.8），加蓋后渦旋1 min，于恒溫烘箱中37℃培養2h。取出后冷卻至室溫，用氨水調ph至8.5（±0.1），混勻，4 000 r/min離心5 min，取上清液備用。
7.3凈化
取上清液（7.2），上樣到活化過的pba固相萃取小柱，控制上樣流速小于3 ml/min；依次用5 ml含有10%乙腈-乙酸銨緩沖溶液（4.12）和2.0 ml 5%氨水甲醇林洗，然后真空抽干5 min，以4.0 ml洗脫溶液（4.10）洗脫至10 ml玻璃管中，在45℃用氮氣濃縮儀吹干。準確加入1.0 ml乙腈水（體積比90：10）溶液溶解殘渣，過0.22μm濾膜，供液相色譜質譜/質譜儀測定。
7.4測定
7.4.1液相色譜條件
7.4.1.1色譜柱：兩性離子型親水相互作用色譜柱，100mm×3.0 mm（內徑），粒度2.7μm，或相當者。
7.4.1.2流動相：a為5 mmol/l乙酸銨溶液（含0.2%甲酸），b為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1液相色譜的梯度洗脫程序
時間/min
流動相/a%
流動相/b%
0
5
95
2
5
95
4
30
70
5
60
40
6
5
95
10
5
95
7.4.1.3流速：0.4 ml/ min。
7.4.1.4柱溫：30℃。
7.4.1.5進樣量：2μl。
7.4.2質譜條件
7.4.2.1離子化模式：電噴霧電離（esi）正離子模式；
7.4.2.2質譜掃描方式：多反應監測（mrm）；
7.4.2.3其他參考質譜條件參見附錄a。
被測組分選擇1個母離子，2個以上子離子，在相同實驗條件下，樣品中待測物質的保留時間與標準校準溶液中對應濃度標準校準溶液的保留時間偏差在±2.5%之內；且樣品譜圖中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的標準校準溶液譜圖中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過表2規定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。
7.4.4定量測定
內標法定量：用標準工作溶液分別進樣，以分析化合物和內標化合物的峰面積比為縱坐標，以分析化合物和內標化合物的濃度比為橫坐標作標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，標準工作液和待測液中利巴韋林的響應值均應在儀器線性響應范圍內。利巴韋林的保留時間、母離子和子離子參見附錄a表a.1。利巴韋林的標準品選擇離子流色譜圖參見附錄b圖b.1。
7.5空白試驗
除不加試樣外，均按7.1~7.4操作步驟進行。
8結果計算和表述
試樣中利巴韋林的殘留總量利用數據處理系統計算或按式（1）計算，計算結果需扣除空白值。
式中：
x——樣品中利巴韋林殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；
c——標準工作溶液中利巴韋林的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
ci——樣液中內標物的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
a——樣液中利巴韋林的峰面積；
asi——標準工作溶液中內標物的峰面積；
v——樣品溶液最終定容體積，單位為毫升（ml）；
csi——標準工作溶液中內標物的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
ai——樣液中內標物的峰面積；
as——標準工作溶液中利巴韋林的峰面積；
m——最終樣液代表的試樣質量，單位為克（g）。
9測定低限和回收率
9.1測定低限
本方法中利巴韋林的測定低限為1.0μg/kg。
9.2正確度（回收率）
不同基質中利巴韋林殘留量在不同添加水平下的回收率試驗數據參見附錄c表c.1。
進口elisa試劑盒延長反應時間
如何選擇合適的橡膠拉伸強度試驗機，韌恒橡膠檢測設備
一起了解下保安過濾器
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臥式螺旋離心機對不同要求進行的自適應調整
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智能自助體檢一體機超聲波體檢機
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