發酵工業中微生物菌種的退化原因與復壯方法
發酵工業中微生物菌種的退化原因與復壯方法
菌種的退化與復壯
1.菌種的退化現象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉接傳代，菌種本身所具有的優良的遺傳性狀可能得到延續，也可能發生變異。變異有正變異（自發突變）和負變異兩種，其中負變異即菌株生產性能的劣化或有些遺傳標記的丟失，又稱為菌種的退化。但是在生產實踐中，必須將由于培養條件的導致菌種形態和生理上的變異與菌種退化區別開來。因為優良菌株的生產性能是和發酵工藝條件緊密相關的，若培養條件發生變化，如培養基中缺乏某些元素，會導致產孢子數量減少，也會引起孢子顏色的改變。溫度、ph的變化也會使發酵產量發生波動等，但只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。
常見的菌種退化現象中，易覺察到的是菌落形態、細胞形態和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變、畸形細胞的出現等；菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失，例如放線菌、莓菌在斜面上多次傳代后產生“光禿”現象等，從而造成生產上用孢子接種的困難；菌種代謝產物的生產能力或其對宿主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗生素發酵單位的減少，枯草芽孢桿菌產能力的衰退等。所有這些都對發酵生產不利。因此，為了使菌種的優良性狀延續下去，必須做好菌種的復壯工作，即在各菌種的優良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
2.菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是相關基因發生了負突變。當控制產量的基因發生負突變，就會引起產量下降；當控制孢子生成的基因發生負突變，則使菌種產孢子性能下降。般而言，菌種的退化是個從量變到質變的逐步演變過程：開始時，在群體中只有個別細胞發生負突變，這時如不及時發現并采用有效措施而是味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，后占優勢，從而使整個群體表現出嚴重的退化現象，因此，突變在數上的表現依賴于傳代，即菌株處于定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數量上逐漸占優勢，于是退化性狀的表現就更加明顯，逐漸成為株退化了的菌體。同時，對某菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發生生產性能的突變不是很容易的，但就個經常處于旺盛生長狀態的細胞而言，發生突變的概率比處于休眠狀態的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關系密切，應設法控制細胞保藏的環境，使細胞處于休眠狀態，從而減少菌種的退化，
3.防止退化的措施
（1）合理的育種
選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞；合理選釋誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少回復突變；在誘變處理后進行充分的后培養及純化突變，以保證保藏藍種純粹。這些都可有效地防止菌種的退化。
（2）選用合適的培養基
有人發現用老苜著根汁培養基培養“5406”抗生藍——細黃鏈霉菌可以防止它的退化，在赤霉菌產生菌藤倉赤霉的培養基中，加入糖蜜、天門冬素、、5-核苷酸或等物質時，也有防止菌種退化的效果，也可選取營養相對貧乏的培養基作為菌種保藏培養基，如培養基中適當限制容易利用的葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過藍株的生長繁殖而產生的，當培養基營養豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化概率。
（3）創造良好的培養條件
在生產實踐中，創造和發現個適合原種生長的條件可以防止菌種遲化，如低溫、于燥、缺氧等。在棲土曲霉3.942的培養中，有人曾用改變培養溫度的措施（從20~30℃提高到33~34℃）來防止其產孢子能力的退化。
（4）控制傳代次數
由于微生物存在著自發突變，而突變都是在繁殖過程中發生的，所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到低水平，以降低自發突發的概率，菌種傳代次數越多，產生突變的凝率就越高，因而菌種發生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數，并根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其他的保藏方式（真空冷凍于燥保藏、沙土管保藏、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
（5）利用不同類型的細胞進行移種傳代
在有些薇生物中，如放線菌和霉菌，由于其細胞中常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現不純和衰退的現象，而孢子般是單核的，用它接種時就沒有這種現象發生，有人在實踐中發現構巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地蘸取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。
4.退化菌種的復壯
退化菌種的復壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現，其中種是從退化菌種的群體中找出少數尚未退化的個體，以恢復菌種原有的典型性狀。另種是在菌種的生產性能尚未退化前就經常有意識地進行純種分離和生產性能的測定工作，以使菌種的生產性能逐步提高。所以這實際上是種利用自發突變不斷從生產中進行選種的工作。
其體的菌種的復壯措施如下。
（1）純種分離
采用平板劃線分離法、平板稀釋法或涂布法均可。把仍保持原有典型優良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養恢復原菌株的典型優良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養恢復原菌株性狀。
（2）通過宿主進行復壯
寄生型數生物的退化菌株可接種到相應宿主體內以提高菌株的活力，
（3）聯合復壯
對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的dtg聯合處理進行復壯。
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1.菌種的退化現象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉接傳代，菌種本身所具有的優良的遺傳性狀可能得到延續，也可能發生變異。變異有正變異（自發突變）和負變異兩種，其中負變異即菌株生產性能的劣化或有些遺傳標記的丟失，又稱為菌種的退化。但是在生產實踐中，必須將由于培養條件的導致菌種形態和生理上的變異與菌種退化區別開來。因為優良菌株的生產性能是和發酵工藝條件緊密相關的，若培養條件發生變化，如培養基中缺乏某些元素，會導致產孢子數量減少，也會引起孢子顏色的改變。溫度、ph的變化也會使發酵產量發生波動等，但只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。
常見的菌種退化現象中，易覺察到的是菌落形態、細胞形態和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變、畸形細胞的出現等；菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失，例如放線菌、莓菌在斜面上多次傳代后產生“光禿”現象等，從而造成生產上用孢子接種的困難；菌種代謝產物的生產能力或其對宿主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗生素發酵單位的減少，枯草芽孢桿菌產能力的衰退等。所有這些都對發酵生產不利。因此，為了使菌種的優良性狀延續下去，必須做好菌種的復壯工作，即在各菌種的優良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
2.菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是相關基因發生了負突變。當控制產量的基因發生負突變，就會引起產量下降；當控制孢子生成的基因發生負突變，則使菌種產孢子性能下降。般而言，菌種的退化是個從量變到質變的逐步演變過程：開始時，在群體中只有個別細胞發生負突變，這時如不及時發現并采用有效措施而是味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，后占優勢，從而使整個群體表現出嚴重的退化現象，因此，突變在數上的表現依賴于傳代，即菌株處于定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數量上逐漸占優勢，于是退化性狀的表現就更加明顯，逐漸成為株退化了的菌體。同時，對某菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發生生產性能的突變不是很容易的，但就個經常處于旺盛生長狀態的細胞而言，發生突變的概率比處于休眠狀態的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關系密切，應設法控制細胞保藏的環境，使細胞處于休眠狀態，從而減少菌種的退化，
3.防止退化的措施
（1）合理的育種
選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞；合理選釋誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少回復突變；在誘變處理后進行充分的后培養及純化突變，以保證保藏藍種純粹。這些都可有效地防止菌種的退化。
（2）選用合適的培養基
有人發現用老苜著根汁培養基培養“5406”抗生藍——細黃鏈霉菌可以防止它的退化，在赤霉菌產生菌藤倉赤霉的培養基中，加入糖蜜、天門冬素、、5-核苷酸或等物質時，也有防止菌種退化的效果，也可選取營養相對貧乏的培養基作為菌種保藏培養基，如培養基中適當限制容易利用的葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過藍株的生長繁殖而產生的，當培養基營養豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化概率。
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（4）控制傳代次數
由于微生物存在著自發突變，而突變都是在繁殖過程中發生的，所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到低水平，以降低自發突發的概率，菌種傳代次數越多，產生突變的凝率就越高，因而菌種發生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數，并根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其他的保藏方式（真空冷凍于燥保藏、沙土管保藏、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
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4.退化菌種的復壯
退化菌種的復壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現，其中種是從退化菌種的群體中找出少數尚未退化的個體，以恢復菌種原有的典型性狀。另種是在菌種的生產性能尚未退化前就經常有意識地進行純種分離和生產性能的測定工作，以使菌種的生產性能逐步提高。所以這實際上是種利用自發突變不斷從生產中進行選種的工作。
其體的菌種的復壯措施如下。
（1）純種分離
采用平板劃線分離法、平板稀釋法或涂布法均可。把仍保持原有典型優良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養恢復原菌株的典型優良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養恢復原菌株性狀。
（2）通過宿主進行復壯
寄生型數生物的退化菌株可接種到相應宿主體內以提高菌株的活力，
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