熒光定量PCR原理
所謂實時熒光定量pcr技術 ，是指在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個pcr進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。以下便是天津本生生物就熒光定量pcr原理的簡要說明，一起來看下：
檢測方法：
1.sybrgreenⅰ法：在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與pcr產物的增加*同步。sybr定量pcr擴增熒光曲線圖pcr產物熔解曲線圖(單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性)
2.taqman探針法：探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;pcr擴增時，taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產物的形成*同步。
1. 熒光閾值(threshold)的設定pcr反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省(默認)設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*sdcycle 3-152. ct值與起始模板的關系每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，公式如下。ct=-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)n為擴增反應的循環(huán)次數(shù)，x0為初始模板量，ex為擴增效率，n為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
實時熒光定量pcr所使用的熒光物質可分為兩種：
1. taqman熒光探針：pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;pcr擴增時，taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產物形成*同步。而新型taqman-mgb探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變(snp)，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的當選技術平臺。
2. sybr熒光染料：在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料非特異性地摻入dna雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與pcr產物的增加*同步。sybr僅與雙鏈dna進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定pcr反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。pcr產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定dna序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 。
1.傳統(tǒng)定量pcr方法簡介：
1)內參照法：在不同的pcr反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在pcr產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2)競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化pcr產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3)pcr-elisa法：利用digaoxin或*等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗digaoxin或*酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的pcr-elisa法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。
2.內標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即pcr到達平臺期后進行檢測，而pcr經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔pcr儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3.內標對定量pcr的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內標，則pcr反應變?yōu)殡p重pcr，雙重pcr反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。 實時熒光定量pcr技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。
因此，實時熒光定量pcr無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1)ct值的重現(xiàn)性pcr循環(huán)在到達ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期)，此時微小誤差尚未放大，因此ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的ct值是恒定的。
2)ct值與起始模板的線性關系由于ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量pcr是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量pcr是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。 各級各類醫(yī)療機構、大學及研究所、cdc、檢驗*、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。由于qpcr是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優(yōu)
注：本信息終歸屬權：本生(天津)健康科技有限公司，以上信息僅供參考!
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2.taqman探針法：探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;pcr擴增時，taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產物的形成*同步。
1. 熒光閾值(threshold)的設定pcr反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省(默認)設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*sdcycle 3-152. ct值與起始模板的關系每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，公式如下。ct=-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)n為擴增反應的循環(huán)次數(shù)，x0為初始模板量，ex為擴增效率，n為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
實時熒光定量pcr所使用的熒光物質可分為兩種：
1. taqman熒光探針：pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;pcr擴增時，taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產物形成*同步。而新型taqman-mgb探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變(snp)，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的當選技術平臺。
2. sybr熒光染料：在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料非特異性地摻入dna雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與pcr產物的增加*同步。sybr僅與雙鏈dna進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定pcr反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。pcr產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定dna序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 。
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1)內參照法：在不同的pcr反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在pcr產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2)競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化pcr產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3)pcr-elisa法：利用digaoxin或*等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗digaoxin或*酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的pcr-elisa法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。
2.內標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即pcr到達平臺期后進行檢測，而pcr經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔pcr儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3.內標對定量pcr的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內標，則pcr反應變?yōu)殡p重pcr，雙重pcr反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。 實時熒光定量pcr技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。
因此，實時熒光定量pcr無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1)ct值的重現(xiàn)性pcr循環(huán)在到達ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期)，此時微小誤差尚未放大，因此ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的ct值是恒定的。
2)ct值與起始模板的線性關系由于ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量pcr是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量pcr是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。 各級各類醫(yī)療機構、大學及研究所、cdc、檢驗*、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。由于qpcr是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優(yōu)
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