Fish探針標記方法大全
1、dna的缺口平移法
缺口平移是一種快速、簡便、成本相對較低以及生產高比活性均一標記dna的方法。該技術可以制備序列特異的探針。當使用重組質粒探針時，雖然任何形式的雙鏈dna都可以進行缺口平移標記。但通常使用限制性核酸內切酶將插入片段進行酶切和凝膠電泳純化后再進行缺口平移標記。此外，用這種探針進行雜交可產生較低的背景信號。
2、dna的隨機引物法
這種方法是使用寡核苷酸引物和大腸桿菌dna聚合酶ⅰ的klenow片段來標記dna pian段。這種方法可代替缺口平移產生均一的標記探針外，還在許多方面優于缺口平移法，比如標記核苷酸在dna探針中的摻入率可達50％以上。由于在反應過程中加入的dna pian段不被降解，故在隨機引物反應中加入的dna可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地標記。dna pian段的大小不影響標記的結果。標記物沿所加入的全長dna被均等地摻入。標記的探針可以直接使用而不需要去除未摻入的核苷酸；單鏈雙鏈dna都可作為隨機引物標記的模版。隨機引物可用于較小的dna pian段（100~500 bp），而缺口平移法對大dna pian段（>1000 bp）效果。隨機引物法的主要缺點是產生的標記探針量比缺口平移的要少些，此外環狀dna不能有效地標記，必須先用限制性內切核酸酶線形化或用堿法或dna酶ⅰ產生缺口。
3、rna的體外轉錄法
體外轉錄法標記rna探針可用于商品化轉錄質粒來制備。這些質粒中應該包括sp6、t3、或t7 rna聚合酶的rna啟動位點和，而這些啟動位點則與多克隆位點（multiple cloning sites，mcs）相鄰。
4、rna的寡脫氧核苷酸法
克隆質粒psp64、pgem-3、pgem-4等含鄰近mcs的sp6rna啟動子，可作為從dna寡核苷酸模版產生rna探針的基礎。這兩種標記方法產生探針量大，而且產生的探針不受載體序列的影響，所需要的線性化的質粒dna大約1 ug，但需要高純度的模板。
5、寡核苷酸的“接尾法”
末端脫氧核苷酸轉移酶可將三磷酸脫氧核苷加到dna分子游離的3’-oh末端。這種脫氧核苷酸連接將在探針3’末端形成一個延伸的“尾巴”。用這種方法可加上許多基因以產生高比活性的探針，適用于基因庫中克隆序列的鑒定，基因組dna樣品的點突變檢測和原位雜交。
6、5’端寡核苷酸的t4多聚核苷酸激酶法
t4多聚核苷酸激酶可將γ-32p-atp的γ-磷轉移到游離的5’-oh端上。合成寡脫氧核糖核苷酸時，它們通常未被磷酸化，因而在5’端應含有一個羥基。由于探針分子只摻入了一個同位素分子，故探針活性與其長度有關。短寡核苷酸可被高比活性標記，而較長的探針活性則隨其長度增加而降低。這種激酶標記方法zui常用于dna序列測定。
7、聚合酶鏈反應標記法
聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，pcr）用于標記比活性dna pian段，這種技術具有很高的特異性，可以在1~2 h之內大量合成探針dna pian段，標記物的摻入率可高達70％~80％。因此，pcr標記技術特別適用于大規模檢測和非放射性標記。該方法的缺點是需要合成一對特異性pcr引物。使用從探針dna上制備的小片段引物也能取得較好的標記效果。
一般來說，核酸探針的檢測方法應根據核酸探針的標記物來決定。放射性同位素可通過放射自顯影而使其標記的核酸探針得到檢測。下面為非放射性標記探針的檢測：①堿性磷酸酶（akp）顯示系統。aso-akp + bcip（ph9.5）→ bcl-oh + pi；bcl-oh + nbt → 紫色。此系統中核酸探針以akp為標記物。aso：等位基因特異的寡核苷酸，bcip：5-溴-4氯-3-吲哚磷酸，nbt：四氮唑藍，pi：磷酸。②辣根過氧化物酶（hrp）顯示系統。hrp + h2o2 → [hrp: h2o2 ]；oda-nh2 + [hrp: h2o2 ] → oda-n = oda/棕色 + hrp + h2o。此系統的核酸探針以hrp為標記物。oda：鄰-聯茴香胺。③abc顯示系統。dna-b + sa-酶 → dna-b-sa 或dna-b + sa-*化的酶 → dna-b-sa-*化的酶。此系統的核酸探針以*（biotin，b）為標記物，然后利用親和素（avidin，a）、*以及酶三者形成的復合物（complex，c）在該酶的顯色反應下以完成對核酸探針的檢測。sa：streptavidin-鏈酶親合素，abc即為avidin-biotin-enzyme complex-親合素-*-酶復合物。酶可選用akp或hrp，然后以各自的酶顯色系統進行顯示。
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2、dna的隨機引物法
這種方法是使用寡核苷酸引物和大腸桿菌dna聚合酶ⅰ的klenow片段來標記dna pian段。這種方法可代替缺口平移產生均一的標記探針外，還在許多方面優于缺口平移法，比如標記核苷酸在dna探針中的摻入率可達50％以上。由于在反應過程中加入的dna pian段不被降解，故在隨機引物反應中加入的dna可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地標記。dna pian段的大小不影響標記的結果。標記物沿所加入的全長dna被均等地摻入。標記的探針可以直接使用而不需要去除未摻入的核苷酸；單鏈雙鏈dna都可作為隨機引物標記的模版。隨機引物可用于較小的dna pian段（100~500 bp），而缺口平移法對大dna pian段（>1000 bp）效果。隨機引物法的主要缺點是產生的標記探針量比缺口平移的要少些，此外環狀dna不能有效地標記，必須先用限制性內切核酸酶線形化或用堿法或dna酶ⅰ產生缺口。
3、rna的體外轉錄法
體外轉錄法標記rna探針可用于商品化轉錄質粒來制備。這些質粒中應該包括sp6、t3、或t7 rna聚合酶的rna啟動位點和，而這些啟動位點則與多克隆位點（multiple cloning sites，mcs）相鄰。
4、rna的寡脫氧核苷酸法
克隆質粒psp64、pgem-3、pgem-4等含鄰近mcs的sp6rna啟動子，可作為從dna寡核苷酸模版產生rna探針的基礎。這兩種標記方法產生探針量大，而且產生的探針不受載體序列的影響，所需要的線性化的質粒dna大約1 ug，但需要高純度的模板。
5、寡核苷酸的“接尾法”
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6、5’端寡核苷酸的t4多聚核苷酸激酶法
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7、聚合酶鏈反應標記法
聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，pcr）用于標記比活性dna pian段，這種技術具有很高的特異性，可以在1~2 h之內大量合成探針dna pian段，標記物的摻入率可高達70％~80％。因此，pcr標記技術特別適用于大規模檢測和非放射性標記。該方法的缺點是需要合成一對特異性pcr引物。使用從探針dna上制備的小片段引物也能取得較好的標記效果。
一般來說，核酸探針的檢測方法應根據核酸探針的標記物來決定。放射性同位素可通過放射自顯影而使其標記的核酸探針得到檢測。下面為非放射性標記探針的檢測：①堿性磷酸酶（akp）顯示系統。aso-akp + bcip（ph9.5）→ bcl-oh + pi；bcl-oh + nbt → 紫色。此系統中核酸探針以akp為標記物。aso：等位基因特異的寡核苷酸，bcip：5-溴-4氯-3-吲哚磷酸，nbt：四氮唑藍，pi：磷酸。②辣根過氧化物酶（hrp）顯示系統。hrp + h2o2 → [hrp: h2o2 ]；oda-nh2 + [hrp: h2o2 ] → oda-n = oda/棕色 + hrp + h2o。此系統的核酸探針以hrp為標記物。oda：鄰-聯茴香胺。③abc顯示系統。dna-b + sa-酶 → dna-b-sa 或dna-b + sa-*化的酶 → dna-b-sa-*化的酶。此系統的核酸探針以*（biotin，b）為標記物，然后利用親和素（avidin，a）、*以及酶三者形成的復合物（complex，c）在該酶的顯色反應下以完成對核酸探針的檢測。sa：streptavidin-鏈酶親合素，abc即為avidin-biotin-enzyme complex-親合素-*-酶復合物。酶可選用akp或hrp，然后以各自的酶顯色系統進行顯示。
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