哪些因素會影響色譜柱的使用壽命？
色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
一、注意流動相因素
1.流動相ph
不同基質的填料具有不同的ph適用范圍。常溫下無定形硅膠在純水中的溶解度約為100mg·l-1，且在ph 1～9的范圍內溶解的硅膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對于硅膠基質的填料,其所能承受的流動相ph范圍約為1～8。鍵合相硅膠填料則由于鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應范圍大大增加，如現在廣泛使用的反相色譜填料c18 (十八烷基硅烷鍵合硅膠)，其ph適用范圍可達2～10。當流動相ph值超出酸性范圍時，鍵合相易發生水解而流失；當流動相ph超出堿性范圍時，會加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，這兩種反應均是不可逆反應，特別是在溫度較高(>40℃)的環境下，會使柱效迅速降低而報廢。
2.流動相變質
當前使用為廣泛的是硅基鍵合相填料，當以水溶液作為流動相或流動相中含有一定濃度的磷酸鹽緩沖液時，水溶液中或緩沖鹽溶液中會滋生出一些細菌或霉菌，從而堵塞固定相顆粒間的空隙。特別是對于多元自動比例混合的液相色譜儀來說,水相或緩沖鹽相獨立存貯，因存放時間較長而容易發生此類問題。
3.流動相純度
目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑范圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會有大量的流動相通過,如流動相含有微量不溶性雜質顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機械性堵塞,引起柱壓升高而無法正常使用。
4.其它因素
如，流動相的極性對柱子也有一定影響，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質會破壞硅膠填料柱，正丁醇、二氯甲烷等極性小的物質會破壞化學鍵合硅膠柱，堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
二、樣品因素
1.樣品的溶解性
樣品試樣在配制中，如有少量微粒未能*溶解，則會隨試樣一起進入色譜柱，同樣，會沉積在柱頭處，造成色譜柱的堵塞。
2.樣品的純度
樣品中可能含有待分析組分以外的各種組分或雜質，這些組分或雜質可能會在柱內產生不可逆吸附，從而，使固定相的活性點被覆蓋，保留特性發生變化。
3.樣品的化學性質
待測試樣中的各種組分與填料之間應具有化學穩定性，比較典型的是在使用氨基鍵合柱時，應避免使用含羰基的化合物和流動相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的nh2和酐、酮發發希夫(schiff)縮合而使固定相破壞。
三、其它因素
影響色譜柱壽命的因素很多，除流動相和樣品因素外，還有其它一些外在因素，如，柱壓的影響，溫度的影響，色譜柱的正確沖洗，色譜柱的正確安裝等。
四、八大注意事項
1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此，在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。
2.應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
3.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
4.選擇使用適宜的流動相(尤其是ph)，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
5.經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右。
(下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略后用水沖洗這一步。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物)、甲醇、水依次沖洗。)
6.保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在ph=2～9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。
8.新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如，ods柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在hplc儀上柱子如不經常使用，應每隔4～5天開機沖洗15分鐘。
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不同基質的填料具有不同的ph適用范圍。常溫下無定形硅膠在純水中的溶解度約為100mg·l-1，且在ph 1～9的范圍內溶解的硅膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對于硅膠基質的填料,其所能承受的流動相ph范圍約為1～8。鍵合相硅膠填料則由于鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應范圍大大增加，如現在廣泛使用的反相色譜填料c18 (十八烷基硅烷鍵合硅膠)，其ph適用范圍可達2～10。當流動相ph值超出酸性范圍時，鍵合相易發生水解而流失；當流動相ph超出堿性范圍時，會加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，這兩種反應均是不可逆反應，特別是在溫度較高(>40℃)的環境下，會使柱效迅速降低而報廢。
2.流動相變質
當前使用為廣泛的是硅基鍵合相填料，當以水溶液作為流動相或流動相中含有一定濃度的磷酸鹽緩沖液時，水溶液中或緩沖鹽溶液中會滋生出一些細菌或霉菌，從而堵塞固定相顆粒間的空隙。特別是對于多元自動比例混合的液相色譜儀來說,水相或緩沖鹽相獨立存貯，因存放時間較長而容易發生此類問題。
3.流動相純度
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4.其它因素
如，流動相的極性對柱子也有一定影響，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質會破壞硅膠填料柱，正丁醇、二氯甲烷等極性小的物質會破壞化學鍵合硅膠柱，堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
二、樣品因素
1.樣品的溶解性
樣品試樣在配制中，如有少量微粒未能*溶解，則會隨試樣一起進入色譜柱，同樣，會沉積在柱頭處，造成色譜柱的堵塞。
2.樣品的純度
樣品中可能含有待分析組分以外的各種組分或雜質，這些組分或雜質可能會在柱內產生不可逆吸附，從而，使固定相的活性點被覆蓋，保留特性發生變化。
3.樣品的化學性質
待測試樣中的各種組分與填料之間應具有化學穩定性，比較典型的是在使用氨基鍵合柱時，應避免使用含羰基的化合物和流動相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的nh2和酐、酮發發希夫(schiff)縮合而使固定相破壞。
三、其它因素
影響色譜柱壽命的因素很多，除流動相和樣品因素外，還有其它一些外在因素，如，柱壓的影響，溫度的影響，色譜柱的正確沖洗，色譜柱的正確安裝等。
四、八大注意事項
1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此，在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。
2.應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
3.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
4.選擇使用適宜的流動相(尤其是ph)，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
5.經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右。
(下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略后用水沖洗這一步。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物)、甲醇、水依次沖洗。)
6.保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在ph=2～9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。
8.新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如，ods柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在hplc儀上柱子如不經常使用，應每隔4～5天開機沖洗15分鐘。
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