人硫酸褪黑色素(MS)ELISA 試劑盒的應用及操作步驟！
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 試劑盒的應用及操作步驟！
一、背景
人硫酸褪黑色素(ms)elisa試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿或其它相關生物液體中硫酸褪黑色素(ms)的含量。
檢測原理：本試劑盒采用雙抗體夾心elisa法。用硫酸褪黑色素(ms)抗體包被于酶標板上，實驗時樣品（或標準品）中的硫酸褪黑色素(ms)會與包被抗體結合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的硫酸褪黑色素(ms)抗體，hrp-鏈霉親和素結合物,最后加入單組份tmb底物液。tmb在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測od值，硫酸褪黑色素(ms)濃度與od450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中硫酸褪黑色素(ms)的濃度。
二、樣品收集
1、血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2、血漿：抗凝劑推薦使用edta-na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。
3、組織勻漿：用預冷的pbs(0.01m,ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9ml的pbs，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4、細胞培養上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。
三、操作步驟
1、使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2、根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3、加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4、甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5、每孔加入100ul的親和鏈酶素-hrp，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6、甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7、每孔加入底物a、b各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8、取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9、在450nm波長處測定各孔的od值。
四、應用
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 試劑盒可用于高血壓病證型與血清褪黑色素水平的相關性研究：
觀察血清褪黑素水平在高血壓病分級、危險分層、不同證型、主要癥狀間的差異,探討其與高血壓病以及證型是否具有相關性。
方法：收集病人244例受試者,其中高血壓病患者184例,正常組60例。根據觀察表詢問患者主要臨床癥狀,根據診斷標準將高血壓病分為肝陽上亢、肝腎陰虛、陰陽兩虛、氣虛痰濁四個證型。收集患者家庭自測血壓登記本,約患者上午8：00~9：00進行血壓檢測,并采集患者血液標本,常溫下放置1小時,離心血液標本,提取血清,并做好冷凍保存。運用酶聯免疫法檢測人褪黑素水平,觀察褪黑素水平在四個證型、主要癥狀間、高血壓病分級、高血壓病危險分層間的的差異。
結果：
1、184例高血壓病患者按照觀察表中所列23個癥狀中,大于40%的主要有10個癥狀,分別為眩暈、健忘、夜尿頻、氣短、腰酸、失眠多夢、耳鳴、口干、頭痛、胸悶,五名的為眩暈（63.5%）、健忘（60.8%）、夜尿頻（55.9%）、腰酸（47.2%）、失眠多夢（47.2%）。
2、根據高血壓病患者有無頭暈、健忘、夜尿頻、氣短、腰酸、耳鳴、口干、頭痛、胸悶等10個癥狀分為2組,比較組間褪黑素差異有無統計學意義,統計結果提示均p值大于0.05,無統計學意義。對患者臨床癥狀積分進行分組（癥狀積分≤10和癥狀積分＞10）,兩組間無統計學意義。
3、對184例高血壓病患者的基本情況即性別、年齡、家族史（表3-表5）,進行分組,比較組間褪黑素水平差異,其中性別組別、家族史組別血清褪黑素水平差異,無統計學意義。但年齡組別中,年齡小于40歲年齡組與40~60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統計學意義。年齡小于40歲組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統計學意義。40~60歲年齡組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.02＜0.05,差異具有統計學意義。
4、對高血壓病患者患病年限、高血壓病血壓分級、高血壓病危險分層、血壓控制是否達標以及采集標本時所測的血壓值與褪黑素水平的相關性進行了統計分析,研究結果（表6-表11）表明正常對照組、高血壓病患病年限（n）≤1兩組分別與n＞1（1＜n≤5、5＜n≤10、n＞10）的其他3組相比,血清褪黑素水平均高于后3組,且差異具有統計學意義；n＞1的3組血清褪黑素水平差異無統計學意義。高血壓病1級、正常組與2級、3級組進行比較,p＜0.05,差異具有統計學意義,2級與3級比較,p＞0.05,差異不具有統計學意義。正常組與高血壓病1級比較,p＜0.05,差異具有統計學意義。低危組、正常組分別與中、高、很高危3組比較,p＜0.05,差異具有統計學意義。其余各組兩兩進行t檢驗,p＞0.05,差異不具有統計學意義。血壓控制達標與否與褪黑素水平間的差異不具有統計學意義。采集標本時所測的舒張壓、收縮壓與褪黑素水平無相關性。
5、正常對照組及氣虛痰濁組褪黑素水平均高于肝陽上亢、陰陽兩虛、肝腎兩虛組,且具有統計學意義。正常對照組與氣虛痰濁組褪黑素水平差異無明顯統計學意義。
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一、背景
人硫酸褪黑色素(ms)elisa試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿或其它相關生物液體中硫酸褪黑色素(ms)的含量。
檢測原理：本試劑盒采用雙抗體夾心elisa法。用硫酸褪黑色素(ms)抗體包被于酶標板上，實驗時樣品（或標準品）中的硫酸褪黑色素(ms)會與包被抗體結合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的硫酸褪黑色素(ms)抗體，hrp-鏈霉親和素結合物,最后加入單組份tmb底物液。tmb在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測od值，硫酸褪黑色素(ms)濃度與od450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中硫酸褪黑色素(ms)的濃度。
二、樣品收集
1、血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2、血漿：抗凝劑推薦使用edta-na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。
3、組織勻漿：用預冷的pbs(0.01m,ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9ml的pbs，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4、細胞培養上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。
三、操作步驟
1、使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2、根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3、加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4、甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5、每孔加入100ul的親和鏈酶素-hrp，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6、甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7、每孔加入底物a、b各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8、取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
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四、應用
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 試劑盒可用于高血壓病證型與血清褪黑色素水平的相關性研究：
觀察血清褪黑素水平在高血壓病分級、危險分層、不同證型、主要癥狀間的差異,探討其與高血壓病以及證型是否具有相關性。
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結果：
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2、根據高血壓病患者有無頭暈、健忘、夜尿頻、氣短、腰酸、耳鳴、口干、頭痛、胸悶等10個癥狀分為2組,比較組間褪黑素差異有無統計學意義,統計結果提示均p值大于0.05,無統計學意義。對患者臨床癥狀積分進行分組（癥狀積分≤10和癥狀積分＞10）,兩組間無統計學意義。
3、對184例高血壓病患者的基本情況即性別、年齡、家族史（表3-表5）,進行分組,比較組間褪黑素水平差異,其中性別組別、家族史組別血清褪黑素水平差異,無統計學意義。但年齡組別中,年齡小于40歲年齡組與40~60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統計學意義。年齡小于40歲組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統計學意義。40~60歲年齡組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.02＜0.05,差異具有統計學意義。
4、對高血壓病患者患病年限、高血壓病血壓分級、高血壓病危險分層、血壓控制是否達標以及采集標本時所測的血壓值與褪黑素水平的相關性進行了統計分析,研究結果（表6-表11）表明正常對照組、高血壓病患病年限（n）≤1兩組分別與n＞1（1＜n≤5、5＜n≤10、n＞10）的其他3組相比,血清褪黑素水平均高于后3組,且差異具有統計學意義；n＞1的3組血清褪黑素水平差異無統計學意義。高血壓病1級、正常組與2級、3級組進行比較,p＜0.05,差異具有統計學意義,2級與3級比較,p＞0.05,差異不具有統計學意義。正常組與高血壓病1級比較,p＜0.05,差異具有統計學意義。低危組、正常組分別與中、高、很高危3組比較,p＜0.05,差異具有統計學意義。其余各組兩兩進行t檢驗,p＞0.05,差異不具有統計學意義。血壓控制達標與否與褪黑素水平間的差異不具有統計學意義。采集標本時所測的舒張壓、收縮壓與褪黑素水平無相關性。
5、正常對照組及氣虛痰濁組褪黑素水平均高于肝陽上亢、陰陽兩虛、肝腎兩虛組,且具有統計學意義。正常對照組與氣虛痰濁組褪黑素水平差異無明顯統計學意義。
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