基因合成常見問題解答1
1、對于合成高難度的基因，需要如何解決的？
高低gc，重復結構
使用像酶切鏈接、多段重組等方式，分成小段，來降低結構對合成的影響。
序列較長
使用多端重組的方式來構建，體外組裝與體內組裝相結合。
特殊載體元件
（如ccdb等）
根據(jù)不同的特殊元件更換相對應的特定感受態(tài)細胞。
其他不可預測的難度
（如有毒性）
嘗試不同的感受態(tài)細胞
2、在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，哪種終止密碼子具有偏好性？
在大腸桿菌中，使用頻率是：taa >tga，tag很少用。
3、在哺乳動物表達系統(tǒng)中，哪種終止密碼子具有偏好性？
在哺乳動物中，使用頻率是：tga>taa>tag。
4、什么是密碼子偏好性？
密碼子偏好性是指不同的生物，對簡并密碼子使用頻率不相同。
5、什么是密碼子優(yōu)化？
密碼子優(yōu)化是一種通過增加靶基因的翻譯效率來提高生物體內蛋白質表達水平的技術。通常會通過避免稀有密碼子，利用偏愛密碼子，簡化mrna的二級結構，優(yōu)化重復序列，消除限制酶切位點，調整gc含量等方法重新設計基因，以提高翻譯效率，進而提高蛋白表達水平。
通常情況下，cai<0.80被認為需要進行密碼子優(yōu)化。
6、什么是cai？
1980年代后期，科學家根據(jù)高表達基因的參考文獻中的密碼子使用頻率創(chuàng)建了密碼子適應指數(shù)cai。
7、coa中酶切驗證的酶切位點的選擇標準是什么？
酶切驗證是一種驗證質粒是否正確的手段，驗證時的酶切位點優(yōu)先選擇位點；優(yōu)先選擇雙酶切，并且兩條帶的大小不一樣；當出現(xiàn)片段太小導致電泳圖不明顯，或者分離的條帶距離太近，不容易分開情況時，選擇最能表現(xiàn)質粒本身特征的其他位點。
8、移碼現(xiàn)象是什么？在設計基因合成或亞克隆方案時如何避免移碼？
每三個堿基表達一個氨基酸，移碼現(xiàn)象是由于基因中增加或減少非三及三的倍數(shù)個堿基，會使得該位點后面的dna序列產生移碼現(xiàn)象，導致表達出來的蛋白非目的蛋白。我們在設計方案時應注意：
a.酶切位點的選擇，如ncoi(ccatgg)，因為其含有一個起始密碼子，所以很容易發(fā)生移碼現(xiàn)象，因此，在使用這類酶切位點時應慎重，可以添加移碼保護堿基；
b.盡量利用載體上已有的序列。
9、什么類型載體的亞克隆難度比較大？
對于大載體、低拷貝載體、背景不清的載體、特殊抗性載體，很難進行亞克隆。例如：pmg36e（紅霉素抗性）和pcyt（氯霉素抗性）等。
10、基因合成的成功率主要由什么決定？我們需要考慮哪些因素？
合成的成功概率主要由dna結構（重復序列、gc含量等因素）和宿主細胞穩(wěn)定性（毒性等因素）來決定。想要提高重組基因合成的成功概率需要考慮以下因素。
主要因素包括：
a.整體gc含量過低（低于20％）或過高（高于80％）；
b.dna序列中的各種gc含量；
c.均聚物（如polya)；
d.重復序列長度≥20bp；
e.小重復序列的個數(shù)以及長度；
f.是否含有回文序列；
11、甲基化現(xiàn)象是什么？
甲基化現(xiàn)象是dna化學修飾的一種形式，是一種表觀遺傳修飾，在不改變dna序列的情況下，改變遺傳表現(xiàn)。
12、基因合成交付什么內容？
（1）基因coa文件
（2）5µg凍干質粒dna
（3）質粒結構圖
（4）測序圖譜
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2、在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，哪種終止密碼子具有偏好性？
在大腸桿菌中，使用頻率是：taa >tga，tag很少用。
3、在哺乳動物表達系統(tǒng)中，哪種終止密碼子具有偏好性？
在哺乳動物中，使用頻率是：tga>taa>tag。
4、什么是密碼子偏好性？
密碼子偏好性是指不同的生物，對簡并密碼子使用頻率不相同。
5、什么是密碼子優(yōu)化？
密碼子優(yōu)化是一種通過增加靶基因的翻譯效率來提高生物體內蛋白質表達水平的技術。通常會通過避免稀有密碼子，利用偏愛密碼子，簡化mrna的二級結構，優(yōu)化重復序列，消除限制酶切位點，調整gc含量等方法重新設計基因，以提高翻譯效率，進而提高蛋白表達水平。
通常情況下，cai<0.80被認為需要進行密碼子優(yōu)化。
6、什么是cai？
1980年代后期，科學家根據(jù)高表達基因的參考文獻中的密碼子使用頻率創(chuàng)建了密碼子適應指數(shù)cai。
7、coa中酶切驗證的酶切位點的選擇標準是什么？
酶切驗證是一種驗證質粒是否正確的手段，驗證時的酶切位點優(yōu)先選擇位點；優(yōu)先選擇雙酶切，并且兩條帶的大小不一樣；當出現(xiàn)片段太小導致電泳圖不明顯，或者分離的條帶距離太近，不容易分開情況時，選擇最能表現(xiàn)質粒本身特征的其他位點。
8、移碼現(xiàn)象是什么？在設計基因合成或亞克隆方案時如何避免移碼？
每三個堿基表達一個氨基酸，移碼現(xiàn)象是由于基因中增加或減少非三及三的倍數(shù)個堿基，會使得該位點后面的dna序列產生移碼現(xiàn)象，導致表達出來的蛋白非目的蛋白。我們在設計方案時應注意：
a.酶切位點的選擇，如ncoi(ccatgg)，因為其含有一個起始密碼子，所以很容易發(fā)生移碼現(xiàn)象，因此，在使用這類酶切位點時應慎重，可以添加移碼保護堿基；
b.盡量利用載體上已有的序列。
9、什么類型載體的亞克隆難度比較大？
對于大載體、低拷貝載體、背景不清的載體、特殊抗性載體，很難進行亞克隆。例如：pmg36e（紅霉素抗性）和pcyt（氯霉素抗性）等。
10、基因合成的成功率主要由什么決定？我們需要考慮哪些因素？
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主要因素包括：
a.整體gc含量過低（低于20％）或過高（高于80％）；
b.dna序列中的各種gc含量；
c.均聚物（如polya)；
d.重復序列長度≥20bp；
e.小重復序列的個數(shù)以及長度；
f.是否含有回文序列；
11、甲基化現(xiàn)象是什么？
甲基化現(xiàn)象是dna化學修飾的一種形式，是一種表觀遺傳修飾，在不改變dna序列的情況下，改變遺傳表現(xiàn)。
12、基因合成交付什么內容？
（1）基因coa文件
（2）5µg凍干質粒dna
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