精品推薦 | 合成DNA片段，何不選用快且準確的方式?
給各位小伙伴們推薦精品之前，小翌先給大家出一道最近小翌碰到的問題╰(*°▽°*)╯
問：已知taq dna酶的最適變性和退火時間為30秒，最適延伸速度是60秒/kb，推薦循環數為35個循環，在克隆實驗中小翌合成5 kb長的dna片段理論上需要多久呢？
a．理論上大概要3個小時左右
b．理論上大概要4個小時左右
c．理論上大概要5個小時左右
d．理論上3分鐘，安排師弟做(???)
答案
b：預變性5min+(變性30s+退火30s+延伸5min)×35+終延伸10min=225min
實際上小翌用這類taq dna酶合成5 kb的片段時，都不止4個小時，pcr儀器本身還有自己的升降溫時間。試想一下，合成5 kb大小的dna片段加上電泳驗證，小翌要花一個下午才能確認(。_。)。除此之外，還有個潛在的風險，那就是辛辛苦苦花一下午合成的片段大小對了，序列不對，有部分堿基突變！
為避免這種情況的發生，辦法是用一個能又快又好合成dna片段的dna合成酶(安排小翌的師弟做)。目前出現了不少合成速度快的高保真酶，那高保真酶究竟是什么呢？
高保真dna聚合酶相比于taq dna 聚合酶有所不同，兩者最大的區別在于前者具有強校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正錯誤插入的核苷酸。當出現錯配的核苷酸時，dna合成會因為錯誤的匹配而暫時停止，期間高保真dna聚合酶將切除錯配的核苷酸并使用正確的核苷酸進行替換。
衡量不同高保真dna聚合酶校正功能的指標是保真度，保真度通常用錯配率的倒數表示(保真度=1/錯配率)，指的是發生錯配的核苷酸數量與合成的總核苷酸數的比值，錯配率越低則表示保真度越好。
dna聚合酶保真度的檢測方法多種多樣，例如藍白班篩選鑒定、一代測序和二代測序等，使用不同的檢測方法結果也會不一樣。
特別推薦2× hieff canace®advancefast pcr master mix
高保真好：低錯配率，高gc易突變序列中堿基錯配比231/300000
擴增速度快：延伸速度快至5 sec/kb，省時高效
適用性廣：可覆蓋20-80%gc含量的基因，耐受小鼠裂解物和20%的血液
穩定性好：37℃下存放7天，不影響產品性能
快速簡便：只需加入引物和模板即可進行擴增，帶有上樣染料，可直接電泳
保真度高，錯配率低
以不同物種基因組為模板，選取6段gc rich、極易發生堿基突變/丟失的片段進行擴增，將各自pcr產物克隆至載體，并對每種序列挑取100個單克隆進行測序以確認堿基序列錯配/突變情況。結果顯示10164es發生堿基錯配/突變的比例優于國內外品牌試劑。
10kb以內片段擴增延伸時間可達5 sec/kb
使用10164es和不同產品均以5 sec/kb的延伸速度從100 ng人基因組模板擴增不同長度片段（0.4-10 kb），延伸時間均要求為5 sec/kb。結果顯示，10164es在10kb以內的片段均可以5 sec/kb的延伸速度擴增。marker: yeasen 10510es。
可擴增不同gc含量的基因片段
使用10164es從人gdna模板中擴增23-76% gc含量片段，延伸時間設置5 sec/kb。結果顯示，產品擴增特異性良好，能兼容不同gc含量片段擴增。marker: yeasen 10510es。
可兼容不同類型的模板
使用10164es從不同樣本中擴增不同長度片段，延伸時間設置5-10 sec/kb。結果顯示本產品擴增特異性良好，能兼容不同模板的不同片段擴增。
圖解：1.小鼠gdna 1 kb；2.小鼠gdna 2 kb；3.小鼠gdna 6 kb；4.玉米gdna 1 kb；5.水稻gdna 2 kb-a；6.水稻gdna 2 kb-b；7.人293細胞cdna 1 kb；8.人293細胞cdna 2 kb ；9.人293細胞cdna 3 kb；10.人293細胞cdna 12 kb；11.大腸桿菌菌液8 kb；12.大腸桿菌菌液16 kb；13.水稻gdna 10 kb-a；14.水稻gdna 10 kb-b；15.水稻gdna 10 kb-c；16.水稻gdna 20 kb-a；17.水稻gdna 20 kb-b；18.人血液直擴3 kb。marker: yeasen 10510es。
用戶使用反饋動物gdna-120bp-50%gc
客戶評價：pcr過程速度快，條帶合適，可在瓊脂糖電泳中直接上樣。進口n品牌的條帶偏上，可能是自身的buffer影響，且未添加loading buffer，該產品可替代目前我的實驗方案中的高保真酶。
植物cdna-729bp-45.13%gc
客戶評價：與進口t品牌相比，克隆條帶更加清晰單一，整個pcr時間也更快，跑膠時不用再額外加染料，非常方便快捷。
微生物gdna-1158、1953bp-58.8%、52.9%gc
客戶評價：與國產v品牌相比，效果相當，個人感覺更佳。
植物cdna-2000bp-40%gc
客戶評價：效果很好，條帶清楚。回到開頭的問題，若小翌使用這款5秒/kb的快速高保真pcr mix擴增5 kb的dna片段用于克隆，理論上大概需要多久？
答案是~
預變性30s+(變性10s+退火5s+延伸25s)×35+終延伸2min=25min50s<<225min ?(`?′)?省時間的同時還減少了錯配情況的發生!
翌圣高保真pcr推薦表
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產品定位
產品名稱
貨號
規格
ta/平末端通用高效拓撲克隆
hieff clone®universal zero topo ta/blunt cloning kit
10906es20
20 t
平末端拓撲克隆
hieff clone®zero topo-blunt cloning kit
10909es20
20 t
平末端拓撲克隆，不含多克隆位點
hieff clone®zero topo-blunt simple cloning kit
10910es20
20 t
單片段同源重組克隆
hieff clone®plus one step cloning kit
10911es20/50
20/50 t
單多片段通用同源重組
hieff clone®universal one step cloning kit
10922es20/50
20/50 t
常規克隆感受態
top 10 chemically competent cell
11801es80
10×100μl
常規克隆感受態
dh5α chemically competent cell
11802es80
10×100 μl
快速克隆感受態
dh5α fast chemically competent cell
11803es80
10×100 μl
常規克隆感受態
bl21(de3) chemically competent cell
11804es80
10×100 μl
快速pcr
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1/5×1 ml
常規條帶分離
agarose瓊脂糖
10208es60
100 g
安全無毒核酸染料
yeared nucleic acid gel stain(10,000× in water)
10202es76
500 μl
真空電弧爐適用于高校、科研院所進行真空冶金新材料的科研與小批量制備
BBQ9-M201B原子吸收測汞儀*優點
電動執行機構安全使用手冊（上）
熱空氣老化試驗機使用中需要注意哪些？
工業互聯網助力*制造 儀器儀表行業加速智能化升級
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中國臺灣福碩 FBL-300W17/W20/360W22/W24輪轂數控車床
SMN系列觸點壓力檢測儀的特點和參數
常用工業PH電極分類
德國REXROTH 4WRKE系列控制閥的日常維護
鉑金片表面張力儀
太赫茲雷達相比微波雷達有哪些優勢呢？西安賽譜自動化
KETT凱特 谷物檢測儀RN-700：提升糧食行業的品質管理與市場競爭力
關于氣體渦街流量計的結構原理與解決不斷流問題
德國AVENTICS二位三通截止閥 R412006260
潛水回流泵主要結構組成說明
德國寶德BURKERT電磁閥包括的類型和作用
斬拌機的配置與構成特點
二氧化氯發生器施工安裝可不能馬虎
使用紅外測油儀時比色皿的使用注意事項和清洗方法
問：已知taq dna酶的最適變性和退火時間為30秒，最適延伸速度是60秒/kb，推薦循環數為35個循環，在克隆實驗中小翌合成5 kb長的dna片段理論上需要多久呢？
a．理論上大概要3個小時左右
b．理論上大概要4個小時左右
c．理論上大概要5個小時左右
d．理論上3分鐘，安排師弟做(???)
答案
b：預變性5min+(變性30s+退火30s+延伸5min)×35+終延伸10min=225min
實際上小翌用這類taq dna酶合成5 kb的片段時，都不止4個小時，pcr儀器本身還有自己的升降溫時間。試想一下，合成5 kb大小的dna片段加上電泳驗證，小翌要花一個下午才能確認(。_。)。除此之外，還有個潛在的風險，那就是辛辛苦苦花一下午合成的片段大小對了，序列不對，有部分堿基突變！
為避免這種情況的發生，辦法是用一個能又快又好合成dna片段的dna合成酶(安排小翌的師弟做)。目前出現了不少合成速度快的高保真酶，那高保真酶究竟是什么呢？
高保真dna聚合酶相比于taq dna 聚合酶有所不同，兩者最大的區別在于前者具有強校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正錯誤插入的核苷酸。當出現錯配的核苷酸時，dna合成會因為錯誤的匹配而暫時停止，期間高保真dna聚合酶將切除錯配的核苷酸并使用正確的核苷酸進行替換。
衡量不同高保真dna聚合酶校正功能的指標是保真度，保真度通常用錯配率的倒數表示(保真度=1/錯配率)，指的是發生錯配的核苷酸數量與合成的總核苷酸數的比值，錯配率越低則表示保真度越好。
dna聚合酶保真度的檢測方法多種多樣，例如藍白班篩選鑒定、一代測序和二代測序等，使用不同的檢測方法結果也會不一樣。
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保真度高，錯配率低
以不同物種基因組為模板，選取6段gc rich、極易發生堿基突變/丟失的片段進行擴增，將各自pcr產物克隆至載體，并對每種序列挑取100個單克隆進行測序以確認堿基序列錯配/突變情況。結果顯示10164es發生堿基錯配/突變的比例優于國內外品牌試劑。
10kb以內片段擴增延伸時間可達5 sec/kb
使用10164es和不同產品均以5 sec/kb的延伸速度從100 ng人基因組模板擴增不同長度片段（0.4-10 kb），延伸時間均要求為5 sec/kb。結果顯示，10164es在10kb以內的片段均可以5 sec/kb的延伸速度擴增。marker: yeasen 10510es。
可擴增不同gc含量的基因片段
使用10164es從人gdna模板中擴增23-76% gc含量片段，延伸時間設置5 sec/kb。結果顯示，產品擴增特異性良好，能兼容不同gc含量片段擴增。marker: yeasen 10510es。
可兼容不同類型的模板
使用10164es從不同樣本中擴增不同長度片段，延伸時間設置5-10 sec/kb。結果顯示本產品擴增特異性良好，能兼容不同模板的不同片段擴增。
圖解：1.小鼠gdna 1 kb；2.小鼠gdna 2 kb；3.小鼠gdna 6 kb；4.玉米gdna 1 kb；5.水稻gdna 2 kb-a；6.水稻gdna 2 kb-b；7.人293細胞cdna 1 kb；8.人293細胞cdna 2 kb ；9.人293細胞cdna 3 kb；10.人293細胞cdna 12 kb；11.大腸桿菌菌液8 kb；12.大腸桿菌菌液16 kb；13.水稻gdna 10 kb-a；14.水稻gdna 10 kb-b；15.水稻gdna 10 kb-c；16.水稻gdna 20 kb-a；17.水稻gdna 20 kb-b；18.人血液直擴3 kb。marker: yeasen 10510es。
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