通過對腫瘤細胞球的高通量共聚焦成像篩選癌癥治療方案
簡介
近年來，在開發腫瘤細胞體外聚集體以用作體內組織環境模型方面取得了顯著進展。當接種至超低黏附圓底微孔板的一個孔中時，這些聚集體會形成一個離散的細胞球。細胞球被認為可比常規二維(2d) 細胞培養更有效地模擬腫瘤行為，因為它們與腫瘤非常相似，同時包含表面暴露和深埋的細胞、增殖和非增殖細胞，并包含具有一個充分氧化的細胞外層和缺氧中心。此類3d 細胞球模型已成功用于環境篩選以鑒定潛在癌癥治療方法。開發可靠細胞球檢測的一些挑戰：
•定位并聚焦于每個孔中的細胞球，以便在單個視野中對其進行成像
•優化化合物和染色處理，以確保染料滲透并避免干擾細胞球的放置
•在整個3d 結構中采集代表性圖像，盡可能減少成像平面上方和下方的離焦或背景信號
•快速分析圖像以產生有意義的結果，從而得出結論
優勢
•以20x 放大倍率在一個視野中捕獲整個細胞球
•以96 孔或384孔形式篩選生物相關的3d 細胞球
•使用共聚焦成像精確檢測細胞應答
•通過僅保存z平面圖像的2d重構來節省存儲空間
細胞球形成和處理
我們使用以下方法從癌細胞系hct116, du145 和hepg2 中形成細胞球。將細胞在37°c 和5% co2的燒瓶中培養，然后分離并接種到96 或384 孔黑色板中，孔底為透明底部u 形孔（分別為corning 4520 和3830），密度為1000-1500 個細胞/孔，在適當培養基中補充胎牛血清（fbs）。在24 小時內，每個孔底部形成單個細胞球，并在37°c 和5% co2條件下繼續生長2-4 天，直至用于實驗（圖1）。細胞球的培養時間可能更長，但大小的增加可能會阻礙染色滲透和中心大多數細胞的成像。本應用說明描述了用于確定抗癌化合物作用的測定方法：依托泊苷、紫杉醇和絲裂霉素c。細胞球處理首先將10 倍濃度的化合物添加到孔中，然后孵育1-4 天，具體取決于正在研究的機制。較短的時間用于研究細胞凋亡，較長的時間用于多參數細胞毒性研究。對于超過2 天的藥物治療，化合物每2 天以1 倍濃度更新一次。
細胞球染色和成像
此處顯示的示例來自開發hct116 細胞球測定法，用于評估除孔中凋亡細胞發生率外的細胞球形態變化。化合物處理完成后，將染色劑以4-6 倍濃度合并成單一混合物，并直接添加到孔中的培養基中。選擇免洗染色劑以避免干擾細胞球。
使用imagexpressmicro confocal 共聚焦高內涵成像系統以10x或20x的放大倍率觀察細胞球。為了分析整個3d 結構中的細胞應答，從細胞球體內的不同深度收集圖像，以創建圖像的“堆棧”。然后使用數學算法將該圖像堆棧組合或“折疊”成單個2d 投影圖像。在這種情況下，使用metaxpress高內涵圖像采集和分析軟件的最大投影算法生成折疊圖像，該算法可使堆疊中的像素保持最亮的強度以生成投影（圖2）。
imagexpressmicro confocal 共聚焦系統可生成更清晰的圖像，以實現更準確的分割
共聚焦光學器件能夠對比寬場光學器件更薄的細胞球光學切片進行成像。這可顯著減少被采集平面上方和下方的熒光發射物體產生的背景模糊。它還允許在亞細胞層面或在彼此聚集或堆疊的細胞之間更好地解析精細細節，因為它們處于3d 結構中。使用共聚焦圖像通常可實現更準確的分割。在使用細胞球的重復實驗中，寬場圖像的細胞核分割比共聚焦圖像中計數的細胞核低約20%（圖3）。
圖1：在高通量篩選環境中檢測細胞球的工作流程單個細胞球可在96 或384 孔板中生長，用化合物處理，并用免洗即可成像的染料混合物染色。若需要，還可以固定細胞球。（右）使用imagexpressmicro confocal 共聚焦系統上的延時采集在63 小時內拍攝hct116 細胞的透射光圖像，以顯示細胞球的形成（10 倍物鏡）。
圖2. 在橫跨細胞球深度約一半的z 平面中采集共聚焦圖像堆疊（左）。在任何給定平面上，只有細胞球的某些細胞處于焦點中，因此，為了便于分析，圖像被折疊成單個2d 圖像，以組合焦點內區域（右）。
使用凋亡檢測篩選抗癌藥物
一類抗癌藥物靶向細胞凋亡的外在途徑，以觸發細胞死亡。為了展示細胞凋亡的測定，用4 種不同抗癌化合物的系列稀釋處理在96 孔板中培養3 天的hct116 細胞球24-48 小時。化合物處理完成后，使用life technologies 的celleventcaspase 和mitotrackerorange 試劑檢測細胞凋亡。將包括hoechst 核染料在內的4 倍混合染料添加到孔中的培養基中。選擇免洗染料以避免干擾細胞球（圖4）。
圖3. （頂部）使用寬場光學器件拍攝的hct116 細胞球的15 張圖像的best focus投影。軟件分割計數817 個細胞核。
由于細胞球邊緣的失焦熒光和中心檢測不佳的較暗的細胞導致失真，因此細胞核被遺漏。（底部）使用共聚焦光學器件拍攝的hct116 細胞球的15 張圖像的best focus投影。計數更加準確，共1078 個細胞核。
用于多參數凋亡檢測
的染色劑目的最終濃度
hoechst
核標記
16.2 μm（10 ug/ml）
cellevent
caspase3/7
細胞凋亡標記物
7.5 μm
mitotracker
orange cmtmros
線粒體電位標記
200 nm
圖4. （頂部）用化合物處理的96 孔板中hct116 細胞球的圖像縮略圖的蒙太奇，以10x plan fluor 物鏡成像。hoechst 染色的細胞核（藍色）被celleventcaspase 3/7 凋亡標記物（綠色）覆蓋。未處理的對照在第4 列，caspase3/7 應答在第5-7 列明顯，其中紫杉醇在a 行從1 μm按1：3 的比例連續稀釋（3個交叉重復）。（左）將十一個z 平面合并為2d 最大投影圖像，并使用簡單的自定義模塊進行分析。原始圖像展示了低水平和高水平的細胞凋亡及其相應的分割掩膜（寶藍= 胞核，粉色= 凋亡細胞）。（右）通過標準化細胞凋亡量與未處理的細胞球相比并繪制圖表，可以看出紫杉醇（綠線）在比絲裂霉素c 或依托泊苷低得多的濃度下誘導了細胞凋亡。
圖5. 抗霉素a 對線粒體的毒性作用。（左圖）hoechst（藍色）和mitotracker（橙色）細胞球的疊加圖像，經1、22、67 和200 nm濃度遞增的抗霉素a 處理。（右）細胞球內識別的線粒體平均強度值圖說明了藥物的作用。
在篩選中對線粒體膜電位進行多重檢測
在上面的凋亡篩選中，線粒體膜電位也可以通過將mitotrackerorange 添加到染料混合物中來評估。或者，可以單獨研究通過影響線粒體代謝來抑制腫瘤生長的藥物。下文展示了使用抗霉素a 進行的測定，抗霉素a 是線粒體膜電位的一種有效干擾物。經過4 小時處理后，根據細胞球內mitotrackerorange 的強度可檢測到線粒體健康。mitotracker要么沒有全部穿透到大細胞球的中心，要么中央的細胞沒有健康的線粒體，正如圖像中線粒體波長通常呈調暗的內部所指出的那樣（圖5）。
迅速篩選微孔板中的3d細胞球
體內3d 培養系統能夠產生大小一致的人癌細胞球，并且能夠使用自動化高通量、高內涵成像篩選細胞球對治療的反應，這是促進化療候選藥物進行更相關檢測的重要步驟。imagexpressmicro confocal 共聚焦系統和metaxpress軟件可對微孔板中的3d 細胞球進行快速成像和分析，以監測抗癌藥物誘導的凋亡和線粒體毒性。
有關優化這些細胞球篩選檢測的采集參數的更多信息，請參閱論文：
sirenko, o. et al., high-content assays
for characterizing the viability and morphology of 3d
cancer spheroid cultures. assay and drug development
technologies, 2015 in press.
HB-801A型眼科*（單路輸出）技術參數
D41FHB31C1NB00常規型號
口服液蓋撕開力試驗機/品質可靠
TC-D2Y速度開關工作原理
10A直流電阻快速測試儀技術參數
通過對腫瘤細胞球的高通量共聚焦成像篩選癌癥治療方案
芝麻餡料水分檢測儀用法與應用標準
硬度測試的方法以及范圍
寧德時代加碼電動化船舶制造！奇瑞退出股東序列
reo變頻器REOVIB MFS 268 DP
一文與您分享國產離心機的常見故障解決方法
全自動器皿清洗機的操作界面設計有哪些重要性？
LWGY-50C渦輪流量計使用注意問題
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吸塑包裝生產的前后工作
高壓截止閥優點
如何使用頗爾pall濾芯能延長其使用壽命？
開放式數控技術應用的現狀及存在問題分析
2018年中國膜產業市場競爭格局及發展前景分析 部分產品性能已經趕超國外產品
pe塑料膜熱收縮包裝機 袖口式塑封機
近年來，在開發腫瘤細胞體外聚集體以用作體內組織環境模型方面取得了顯著進展。當接種至超低黏附圓底微孔板的一個孔中時，這些聚集體會形成一個離散的細胞球。細胞球被認為可比常規二維(2d) 細胞培養更有效地模擬腫瘤行為，因為它們與腫瘤非常相似，同時包含表面暴露和深埋的細胞、增殖和非增殖細胞，并包含具有一個充分氧化的細胞外層和缺氧中心。此類3d 細胞球模型已成功用于環境篩選以鑒定潛在癌癥治療方法。開發可靠細胞球檢測的一些挑戰：
•定位并聚焦于每個孔中的細胞球，以便在單個視野中對其進行成像
•優化化合物和染色處理，以確保染料滲透并避免干擾細胞球的放置
•在整個3d 結構中采集代表性圖像，盡可能減少成像平面上方和下方的離焦或背景信號
•快速分析圖像以產生有意義的結果，從而得出結論
優勢
•以20x 放大倍率在一個視野中捕獲整個細胞球
•以96 孔或384孔形式篩選生物相關的3d 細胞球
•使用共聚焦成像精確檢測細胞應答
•通過僅保存z平面圖像的2d重構來節省存儲空間
細胞球形成和處理
我們使用以下方法從癌細胞系hct116, du145 和hepg2 中形成細胞球。將細胞在37°c 和5% co2的燒瓶中培養，然后分離并接種到96 或384 孔黑色板中，孔底為透明底部u 形孔（分別為corning 4520 和3830），密度為1000-1500 個細胞/孔，在適當培養基中補充胎牛血清（fbs）。在24 小時內，每個孔底部形成單個細胞球，并在37°c 和5% co2條件下繼續生長2-4 天，直至用于實驗（圖1）。細胞球的培養時間可能更長，但大小的增加可能會阻礙染色滲透和中心大多數細胞的成像。本應用說明描述了用于確定抗癌化合物作用的測定方法：依托泊苷、紫杉醇和絲裂霉素c。細胞球處理首先將10 倍濃度的化合物添加到孔中，然后孵育1-4 天，具體取決于正在研究的機制。較短的時間用于研究細胞凋亡，較長的時間用于多參數細胞毒性研究。對于超過2 天的藥物治療，化合物每2 天以1 倍濃度更新一次。
細胞球染色和成像
此處顯示的示例來自開發hct116 細胞球測定法，用于評估除孔中凋亡細胞發生率外的細胞球形態變化。化合物處理完成后，將染色劑以4-6 倍濃度合并成單一混合物，并直接添加到孔中的培養基中。選擇免洗染色劑以避免干擾細胞球。
使用imagexpressmicro confocal 共聚焦高內涵成像系統以10x或20x的放大倍率觀察細胞球。為了分析整個3d 結構中的細胞應答，從細胞球體內的不同深度收集圖像，以創建圖像的“堆棧”。然后使用數學算法將該圖像堆棧組合或“折疊”成單個2d 投影圖像。在這種情況下，使用metaxpress高內涵圖像采集和分析軟件的最大投影算法生成折疊圖像，該算法可使堆疊中的像素保持最亮的強度以生成投影（圖2）。
imagexpressmicro confocal 共聚焦系統可生成更清晰的圖像，以實現更準確的分割
共聚焦光學器件能夠對比寬場光學器件更薄的細胞球光學切片進行成像。這可顯著減少被采集平面上方和下方的熒光發射物體產生的背景模糊。它還允許在亞細胞層面或在彼此聚集或堆疊的細胞之間更好地解析精細細節，因為它們處于3d 結構中。使用共聚焦圖像通常可實現更準確的分割。在使用細胞球的重復實驗中，寬場圖像的細胞核分割比共聚焦圖像中計數的細胞核低約20%（圖3）。
圖1：在高通量篩選環境中檢測細胞球的工作流程單個細胞球可在96 或384 孔板中生長，用化合物處理，并用免洗即可成像的染料混合物染色。若需要，還可以固定細胞球。（右）使用imagexpressmicro confocal 共聚焦系統上的延時采集在63 小時內拍攝hct116 細胞的透射光圖像，以顯示細胞球的形成（10 倍物鏡）。
圖2. 在橫跨細胞球深度約一半的z 平面中采集共聚焦圖像堆疊（左）。在任何給定平面上，只有細胞球的某些細胞處于焦點中，因此，為了便于分析，圖像被折疊成單個2d 圖像，以組合焦點內區域（右）。
使用凋亡檢測篩選抗癌藥物
一類抗癌藥物靶向細胞凋亡的外在途徑，以觸發細胞死亡。為了展示細胞凋亡的測定，用4 種不同抗癌化合物的系列稀釋處理在96 孔板中培養3 天的hct116 細胞球24-48 小時。化合物處理完成后，使用life technologies 的celleventcaspase 和mitotrackerorange 試劑檢測細胞凋亡。將包括hoechst 核染料在內的4 倍混合染料添加到孔中的培養基中。選擇免洗染料以避免干擾細胞球（圖4）。
圖3. （頂部）使用寬場光學器件拍攝的hct116 細胞球的15 張圖像的best focus投影。軟件分割計數817 個細胞核。
由于細胞球邊緣的失焦熒光和中心檢測不佳的較暗的細胞導致失真，因此細胞核被遺漏。（底部）使用共聚焦光學器件拍攝的hct116 細胞球的15 張圖像的best focus投影。計數更加準確，共1078 個細胞核。
用于多參數凋亡檢測
的染色劑目的最終濃度
hoechst
核標記
16.2 μm（10 ug/ml）
cellevent
caspase3/7
細胞凋亡標記物
7.5 μm
mitotracker
orange cmtmros
線粒體電位標記
200 nm
圖4. （頂部）用化合物處理的96 孔板中hct116 細胞球的圖像縮略圖的蒙太奇，以10x plan fluor 物鏡成像。hoechst 染色的細胞核（藍色）被celleventcaspase 3/7 凋亡標記物（綠色）覆蓋。未處理的對照在第4 列，caspase3/7 應答在第5-7 列明顯，其中紫杉醇在a 行從1 μm按1：3 的比例連續稀釋（3個交叉重復）。（左）將十一個z 平面合并為2d 最大投影圖像，并使用簡單的自定義模塊進行分析。原始圖像展示了低水平和高水平的細胞凋亡及其相應的分割掩膜（寶藍= 胞核，粉色= 凋亡細胞）。（右）通過標準化細胞凋亡量與未處理的細胞球相比并繪制圖表，可以看出紫杉醇（綠線）在比絲裂霉素c 或依托泊苷低得多的濃度下誘導了細胞凋亡。
圖5. 抗霉素a 對線粒體的毒性作用。（左圖）hoechst（藍色）和mitotracker（橙色）細胞球的疊加圖像，經1、22、67 和200 nm濃度遞增的抗霉素a 處理。（右）細胞球內識別的線粒體平均強度值圖說明了藥物的作用。
在篩選中對線粒體膜電位進行多重檢測
在上面的凋亡篩選中，線粒體膜電位也可以通過將mitotrackerorange 添加到染料混合物中來評估。或者，可以單獨研究通過影響線粒體代謝來抑制腫瘤生長的藥物。下文展示了使用抗霉素a 進行的測定，抗霉素a 是線粒體膜電位的一種有效干擾物。經過4 小時處理后，根據細胞球內mitotrackerorange 的強度可檢測到線粒體健康。mitotracker要么沒有全部穿透到大細胞球的中心，要么中央的細胞沒有健康的線粒體，正如圖像中線粒體波長通常呈調暗的內部所指出的那樣（圖5）。
迅速篩選微孔板中的3d細胞球
體內3d 培養系統能夠產生大小一致的人癌細胞球，并且能夠使用自動化高通量、高內涵成像篩選細胞球對治療的反應，這是促進化療候選藥物進行更相關檢測的重要步驟。imagexpressmicro confocal 共聚焦系統和metaxpress軟件可對微孔板中的3d 細胞球進行快速成像和分析，以監測抗癌藥物誘導的凋亡和線粒體毒性。
有關優化這些細胞球篩選檢測的采集參數的更多信息，請參閱論文：
sirenko, o. et al., high-content assays
for characterizing the viability and morphology of 3d
cancer spheroid cultures. assay and drug development
technologies, 2015 in press.
HB-801A型眼科*（單路輸出）技術參數
D41FHB31C1NB00常規型號
口服液蓋撕開力試驗機/品質可靠
TC-D2Y速度開關工作原理
10A直流電阻快速測試儀技術參數
通過對腫瘤細胞球的高通量共聚焦成像篩選癌癥治療方案
芝麻餡料水分檢測儀用法與應用標準
硬度測試的方法以及范圍
寧德時代加碼電動化船舶制造！奇瑞退出股東序列
reo變頻器REOVIB MFS 268 DP
一文與您分享國產離心機的常見故障解決方法
全自動器皿清洗機的操作界面設計有哪些重要性？
LWGY-50C渦輪流量計使用注意問題
莊浪：農機引領蘋果產業提速增效
吸塑包裝生產的前后工作
高壓截止閥優點
如何使用頗爾pall濾芯能延長其使用壽命？
開放式數控技術應用的現狀及存在問題分析
2018年中國膜產業市場競爭格局及發展前景分析 部分產品性能已經趕超國外產品
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