解決免疫共沉淀（Co-IP）中的抗體輕重鏈污染問題
解決免疫共沉淀（co-ip）中的抗體輕重鏈污染問題
解決免疫共沉淀（co-ip）中的抗體輕重鏈污染問題
1.免疫共沉淀-互作研究經典方法
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，coip）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經典方法，常用于發現蛋白的互作網絡、鑒定兩蛋白的互作關系。
coip的設計原理是，假設一種已知蛋白是某個大的蛋白復合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可以將整個蛋白復合物從溶液中“拉”下來（常說的“pull-down”），進而可以用于鑒定這個蛋白復合物中的其他未知成員。
coip的特點可以概括為兩點，第一是天然狀態蛋白，第二是蛋白復合物。
大致流程如下圖所示：
2.哪有那么簡單
上面講了原理和流程，看起來很好理解。但研究中往往不像理論那么順利。
在做coip實驗過程中往往會遇到目的蛋白與抗體輕鏈（25kda左右）或者抗體重鏈（55kda左右）的分子量接近的情況，導致ip-wb檢測時無法判斷目的蛋白條帶（如上圖）。
如何解決這種問題，困擾了非常多的小伙伴。
3.問題的根源
其實產生抗體輕、重鏈條帶污染的主要原因是，我們上二抗的時候，pvdf膜上有兩種一抗：
（1）用于coip的一抗脫落后跑電泳并轉印到膜上（上圖紅圈所示）
（2）ip-wb時加入的一抗（上圖紅色箭頭對應的一抗）。
二抗同時識別上面兩種一抗，導致除了目標條帶（紅色箭頭）外，還產生抗體的輕鏈和重鏈條帶（黑色箭頭）。
4.解法
要解決該問題主要就是處理掉圖中的輕、重鏈條帶。
那我們知道做wb要有條帶需要2個要素：目標蛋白、抗體及發光基團。
解法就是分別解決這3個要素，任意一個要素解決了問題就解決了。
1)co-ip抗體共價偶聯到磁珠或者agarose上——這樣在洗脫的時候，抗體就不會被洗到coip產物中去。
（產品推薦：a10003 nhs-activated magarose beads，或者m2001x系列tag-agarose beads產品）；
2)ip-wb檢測一抗直接標記hrp，wb實驗過程中不使用二抗——這樣就不會發生二抗識別coip產物中一抗抗體。
（產品推薦：m200系列hrp標記標簽抗體）；
3)使用一款只識別天然構象抗體的二抗——由于wb過程中，coip產物中一抗抗體變性，該二抗不會識別產生條帶。
（產品推薦：absmart系列二抗）；
上述3種方法中：購買共價偶聯好的tag-agarose beads或者hrp標記的標簽抗體，使用起來很方便，作為實驗選。
但是絕大多數一抗是沒有hrp標記的或者共價偶聯beads的，所以很多實驗室在做內源性蛋白co-ip實驗時就會很煩惱，這時候使用避免抗體輕重鏈的absmart系列二抗，就可以有效地解決這類問題，作為內源性蛋白的co-ip實驗的選。
另外如果co-ip之后，需要質譜鑒定互作蛋白或修飾時，為了排除質譜檢測時抗體的干擾，可以選擇使用nhs- activated magarose beads來共價偶聯一抗，然后做coip實驗將產物進行質譜檢測，這樣可以大大提高質譜檢出蛋白的數量和修飾位點的靈敏度。
下面給大家分享一個實驗結果案例：
南京沃博生物科技有限公司常備現貨
1.tag-agarosebeads產品
m20012:anti-myc-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20013:anti-ha-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20014:anti-gfp-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20018:anti-dykddddk-tagmouseantibody(agarose conjugated)
2.hrp標記的tag產品
m20019: anti-myc-tag antibody (hrp conjugated)
m20020: anti-his-tag antibody (hrp conjugated)
m20021: anti-ha-tag antibody (hrp conjugated)
m20022: anti-gfp-tag antibody(hrp conjugated)
m20025:anti-gst-tag antibody(hrpconjugated)
m20026:anti-dykddddk-tag antibody(hrpconjugated)
3.避免抗體輕重鏈二抗產品
absmart-m21004:goat anti-mouse igg hrp(避免重鏈)
absmart-m21005: goatanti-mouse igg hrp(避免輕鏈)
absmart-m21006: goatanti-rabbit igg hrp(避免重鏈)
absmart-m21007: goatanti-rabbit igg hrp(避免輕鏈)
4.共價偶聯agarose產品
a10003: nhs- activatedmagarose beads
注意：
有同學反饋說使用共價偶聯好的tag-agarose beads產品，在做coip-wb檢測的時候，也會出現抗體輕重鏈。
詳細了解實驗流程后，發現是由于coip實驗的最后一步（互作蛋白洗脫步驟）操作錯誤導致。
即很多同學在3次pbst洗滌之后，直接就加入wb loading buffer進行煮樣，然后就進行sds-page上樣了。這樣操作會導致共價偶聯的抗體被分離下來，在wb中出現抗體輕重鏈的條帶。
正確的操作應該是：1. 3次pbst洗滌之后，加入50-100ul的ph2.5-3.0的甘氨酸溶液（加入體積根據實驗需求自行調整）；2.震蕩混勻，靜置30-60s，離心取上清（磁珠用磁力架）；3.上清中按照體積比1:10（中和液/甘氨酸）加入中和液（中和液為ph9.0的tris溶液）；4.后續在上清液中正常加入wb loading buffer操作即可。
為了方便大家實驗操作，abmart為大家提供了配置好的洗脫液和中和液產品（貨號t10007），該產品也可以作為proa/g產品的洗脫液和中和液。如果是使用flag抗體進行coip實驗，可以使用3*ddddk多肽（貨號t10004）進行洗脫，該產品針對非共價偶聯的flag抗體進行的coip實驗，一樣可以起到避免抗體輕重鏈污染的問題。
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（2）ip-wb時加入的一抗（上圖紅色箭頭對應的一抗）。
二抗同時識別上面兩種一抗，導致除了目標條帶（紅色箭頭）外，還產生抗體的輕鏈和重鏈條帶（黑色箭頭）。
4.解法
要解決該問題主要就是處理掉圖中的輕、重鏈條帶。
那我們知道做wb要有條帶需要2個要素：目標蛋白、抗體及發光基團。
解法就是分別解決這3個要素，任意一個要素解決了問題就解決了。
1)co-ip抗體共價偶聯到磁珠或者agarose上——這樣在洗脫的時候，抗體就不會被洗到coip產物中去。
（產品推薦：a10003 nhs-activated magarose beads，或者m2001x系列tag-agarose beads產品）；
2)ip-wb檢測一抗直接標記hrp，wb實驗過程中不使用二抗——這樣就不會發生二抗識別coip產物中一抗抗體。
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