【課堂】如何成功分離并鑒定*毒株？——意義及實驗詳解
疫情背景
2020年的春天，整個神州大地被*病毒疫情肆虐；所幸是各大科研機構(gòu)全力開展科研攻關(guān)，讓我們看到了曙光和希望。
2月7日，復(fù)旦大學(xué)成功分離并鑒定出*毒株，實驗室已基本完成該病毒株的全基因組序列測定和分析，與*（2019-ncov）參考基因組（epi_isl_402119,gisaid）相比，同源性大于99.9%。隨后，多地也出現(xiàn)了分離毒株的成功案例[1]。
間接免疫熒光顯示病毒感染的細(xì)胞呈現(xiàn)合胞體——來源：復(fù)旦大學(xué)
聞玉梅院士與上海市疾病預(yù)防控制中心挑選多例確認(rèn)病例的鼻/*樣本用于實驗，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院*攻關(guān)團隊通過使用兩種細(xì)胞系（vero-e6和huh7細(xì)胞）接種樣本，從一例病例樣本中，于2月7日成功分離并鑒定出*（2019-ncov）毒株，該毒株在細(xì)胞培養(yǎng)中擴增迅速，可得到較高滴度的病毒；間接免疫熒光法發(fā)現(xiàn)病毒感染細(xì)胞顯示典型冠狀病毒樣病變-合胞體。目前，實驗室已基本完成該病毒株的全基因組序列測定和分析，與*（2019-ncov）參考基因組（epi_isl_402119, gisaid）相比，同源性大于99.9%。經(jīng)進一步純化、擴增和鑒定后，該毒株將為*疫苗、抗病毒的藥物研制和致病機理研究等提供重要的毒種資源[1]。
病毒毒株的定義與分離意義
病毒毒株是什么？
毒株是在實驗室條件下培養(yǎng)的病毒。就是病毒的原生體[2]
不管是對抗哪種病毒，都要進行科學(xué)檢測與實驗，而這些都需要把病毒毒株分離出來。有了毒株，才能進行動物實驗，臨床實驗，后面才能研發(fā)疫苗或相關(guān)藥物。
病毒毒株的分離有什么意義？
1、通過抗體檢測方法判斷和評估人群真實感染情況，對于了解病毒入侵人體的機制具有重要意義。
2、病毒毒株分離后，經(jīng)進一步純化、擴增和鑒定后，將為病毒疫苗、抗病毒的藥物研制和致病機理研究等提供重要的毒種資源。
3、可以用于開展制備疫苗的研究，這對未來預(yù)防疾病具有重要意義。
4、對選擇和制造*的治療藥物，診斷試劑的開發(fā)均具有重要意義。
作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，*的性狀、致病性、易感器官、致病機理、藥物敏感性以及流行規(guī)律都還不是很清楚，所以這次病毒的成功分離將為這些研究提供有力的病原學(xué)支撐。
簡單來說，有了這株毒株，相當(dāng)于我們在和病毒的戰(zhàn)爭中抓了一個俘虜。幫助我們識別它們，我們進行動物實驗，直接觀察病毒如何侵害機體器官，主要侵害哪些器官，會造成什么樣的癥狀，甚至推斷出在人體的致病模型，這些將是我們指導(dǎo)臨床治療的科學(xué)基礎(chǔ)。我們終戰(zhàn)勝病毒的武器之一。
分離并鑒定*毒株實驗流程圖
值得注意的是，不同于細(xì)菌，可以用瓊脂、肉湯等形成外部的營養(yǎng)環(huán)境，通過大規(guī)模的發(fā)酵和濃縮來進行制取; 病毒必須依靠宿主細(xì)胞中的資源來進行自身的復(fù)制、釋放完整病毒顆粒；因此它的分離擴增要通過細(xì)胞來進行培養(yǎng)。
免疫熒光技術(shù)——顯示病毒感染的細(xì)胞
間接免疫熒光法可以成功的發(fā)現(xiàn)分離出來的*肺炎病毒，其中關(guān)鍵設(shè)備之一為生物熒光顯微鏡。事實上，熒光顯微鏡早就廣泛用于呼吸道感染的快速臨床檢測。
免疫熒光技術(shù)（if）又稱免疫抗體技術(shù)，是一種以熒光素標(biāo)記抗體（抗原）而進行抗原（抗體）定位的技術(shù)。該技術(shù)無放射性污染，且操作簡便，特異性強、靈敏度高、檢測速度快，成為臨床檢驗中常用的檢驗手段之一。[3]
應(yīng)用廣泛的熒光素為異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothinocyanate，fitc），其在藍(lán)光的激發(fā)下呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光；是針對呼吸道疾病免疫熒光檢測用試劑的常用熒光素。目前臨床應(yīng)用比較廣泛的，是圍繞fitc染料的，美國的呼吸道七聯(lián)檢試劑盒和西班牙的九項igm抗體檢測試劑盒。
下面我們通過賞析一篇文獻來詳細(xì)看一下：
文獻賞析——通過蛋白冠狀構(gòu)造合成類病毒顆粒使冠狀病毒感染禽類模型的有效接種成為可能[4]
•hui-wen chen. department of veterinary medicine, national taiwan university, taipei, taiwan
•biomaterials volume 106, november 2016, pages 111-118 （2019 if: 10.273 ）
•文獻研究證明了一種簡單而可靠的方法來用合成納米顆粒連接病毒抗原; 改進疫苗應(yīng)用。
•使用熒光顯微鏡leica dmi8，進行成像，分析定量。
•染色：fitc標(biāo)記的抗小鼠igg (jackson immu- noresearch laboratories)孵育1小時。用dapi 復(fù)染。
這篇文獻涉及的對抗的冠狀病毒coronavirus有sars-cov和mers-cov，并非引發(fā)今次疫情的2019*（又稱嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型，sars-cov-2）。但它們同屬冠狀病毒亞科（coronavirus），是不同的變種。[5]
8周大balb/c小鼠通過爪墊內(nèi)（intra-footpad）注射50 ml pbs自由蛋白制劑，或含有2mg病毒抗原的svlps 。24 h后，處死小鼠和收割腘窩淋巴結(jié) (n ¼ 6). 制作冰凍切片(6 mm) (n¼6)。冰凍切片(6 mm)在丙酮中固定10min, 1%多聚甲醛中固定8min。切片用5%正常山羊血清pbs溶液阻斷10分鐘，并用anti-s mab 室溫下孵育4h。沖洗后，切片進一步在fitc標(biāo)記的抗小鼠igg（fitc-conjugated anti-mouse igg (jackson immuno research laboratories)）室溫下孵育1小時。細(xì)胞核用dapi染色，以顯示所有細(xì)胞。熒光信號在leica dmi8熒光顯微鏡(leica dmi8)下觀察，成像分析定量。[4]
svlps的抗原遞送和免疫原性：(a)腘窩淋巴結(jié)切片在明亮視野下(上圖)進行免疫熒光檢測(bottom panel). 淋巴結(jié)切片用dapi(藍(lán)色)和fitc標(biāo)記的anti-ibv spike蛋白抗體(綠色)染色，以檢測淋巴結(jié)內(nèi)抗原含量(b)抗原熒光信號的量化的淋巴結(jié)。bars represent means ± s.d. (n ¼ 6). (c)接種疫苗后14和21天，量化anti-ibv spike蛋白質(zhì)的免疫球蛋白濃度。[4]
實驗關(guān)鍵利器——熒光顯微鏡dmi8
同一品牌
高度整合，高度智能化
軟硬件協(xié)調(diào)工作，故障率少
1、*光學(xué)——leica大視野
25mm 目鏡視野，19mm 成像視野， 保證更大的可視面積，單一視野更多觀察目標(biāo)；更易搜索目標(biāo)視野。
2、*技術(shù)——leica高精度
dmi8 系統(tǒng)的一大特色為以 20 nm 的重定位精度實現(xiàn)閉環(huán)調(diào)焦。在增大的 12 mm 調(diào)焦行程的基礎(chǔ)上，選擇閉環(huán)調(diào)焦，實現(xiàn)多點間歇攝取實驗的高再現(xiàn)性。
3、高穩(wěn)定性：*焦面保持 – 三重保障
afc——徠卡自適應(yīng)調(diào)焦控制
只需單擊一次按鈕，具有 led 光束輔助功能的徠卡自適應(yīng)調(diào)焦控制(afc) 即可自動實時維持對焦。
節(jié)省時間，確保您的間歇成像攝取不受實驗條件變化的影響。
小鼠胚胎發(fā)育（熒光標(biāo)記組蛋白變體h3.3）連續(xù)觀察32 h
4、看得更快 – 實驗速度加快5倍
配有 las x synapse 高級同步快速板的 dmi8 s 成像解決方案消除了系統(tǒng)組件間的瓶頸，從而大大加快了成像速度。通過集成的實時控制器，直接與所有硬件組件、相機和外圍設(shè)備關(guān)聯(lián)，您可以毫秒級的精度控制您的整個系統(tǒng)。
將多位置載物臺實驗與高速外部熒光轉(zhuǎn)換功能相結(jié)合，發(fā)揮市場上配合高精度載物臺控制的快速濾片轉(zhuǎn)盤的優(yōu)勢。
間歇攝取實驗時間可縮短5倍意味著您不但可以節(jié)省時間，還能獲得更多細(xì)節(jié)。不管實驗中使用了哪種儀器組件，系統(tǒng)都將以高可能的速度運行。
帶 las x synapse 的 dmi8 s 可更高效地處理數(shù)據(jù)，幫助您實現(xiàn)較高的攝取速度。
升級來了——革新寬場成像：thunder系統(tǒng)
共聚焦的成像質(zhì)量，寬場的成像速度！
新品：高分辨高速多維成像系統(tǒng)thunder
使用 alexa fluor 568 phalloidin (肌動蛋白) 和 yoyo 1 iodide (細(xì)胞核) 染色的 hela 細(xì)胞球狀細(xì)胞團
高清成像：
136nm光學(xué)分辨率 3d 樣品進行清晰成像
高速多維成像：
3.5分鐘內(nèi)完成96孔板z-stack多層掃描
2分鐘內(nèi)完成熒光玻片掃描
低光毒性：
led冷光源照明，高靈敏成像，保護標(biāo)本活性，減少熒光淬滅
操作簡單：
一鍵成像，實時出圖
thunder imager –高分辨率
xy方向：136nm光學(xué)分辨率，比普通寬場2x提高
xz方向：264nm光學(xué)分辨率，比普通寬場2.5x提高
thunder imager –高速，多維實時成像
thunder是建立在寬場基礎(chǔ)上的，在高分辨率的同時，保留了寬場成像快速的優(yōu)勢。
單維度：每秒90幅2048*2048。
多維度：1920x1440像素，3通道，10層z，96孔板掃描，3分30秒以內(nèi)完成！
thunder imager –應(yīng)用廣泛
figure r: volume rendering of a computationally cleared 150um brain section
z軸掃描平均深度：150um，三維重建示例。
thunder看得更多–觀察面積增大到10,000倍
從一張張圖像搜索轉(zhuǎn)變?yōu)榭吹綐颖镜恼麄€圖像。軟件模塊 las x navigator 就像是標(biāo)本的 gps導(dǎo)航，為您開辟一條通往高質(zhì)量數(shù)據(jù)的清晰路線圖。
創(chuàng)建樣本的概覽圖，立即識別重要細(xì)節(jié)。然后使用載玻片、培養(yǎng)皿和多孔板模板，自動設(shè)置高分辨率圖像攝取。
thunder看得更準(zhǔn)確–找到您的答案
不管您關(guān)注的是哪種實驗，las x navigator 始終是 dmi8 s 平臺上通往所有應(yīng)用的關(guān)鍵。
生成實時概覽圖
創(chuàng)建螺旋掃描，搜索當(dāng)前位置的鄰近區(qū)域
在標(biāo)本夾模板中顯示圖像，進行快速定向
在相同工作空間中使用任何放大倍率、相機、檢測器和反差方法
定義高分辨率掃描或多孔板成像項目的無限多個區(qū)域和位置
快速縮放標(biāo)本
通過鼠標(biāo)單擊即可移動到載物臺上的任何位置
斑馬魚幼魚。來源：ravindra peravali, institute of toxicology and genetics, eggenstein-leopoldshafen, germany.
培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞，做59層z軸斷層掃描。綠色,beta-iii-tubulin;藍(lán)色,細(xì)胞核。
不僅僅可以觀察培養(yǎng)細(xì)胞，對類器官也有效果。
小鼠肺的類器官來源于肺泡莖和祖細(xì)胞。標(biāo)本厚度200um。使用徠卡thunder 3d live cell系統(tǒng)以及20x 干鏡，樣品放置于1mm厚度的普通塑料底12孔板內(nèi)。一樣可得出清晰超凡的三維斷層掃描效果。充分證明了thunder系統(tǒng)應(yīng)用廣泛的特點，不限物鏡！不限樣品器皿！
sample courtesy dr. pumaree kanrai, mpi for heart and lung research, bad nauheim (germany).
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間接免疫熒光顯示病毒感染的細(xì)胞呈現(xiàn)合胞體——來源：復(fù)旦大學(xué)
聞玉梅院士與上海市疾病預(yù)防控制中心挑選多例確認(rèn)病例的鼻/*樣本用于實驗，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院*攻關(guān)團隊通過使用兩種細(xì)胞系（vero-e6和huh7細(xì)胞）接種樣本，從一例病例樣本中，于2月7日成功分離并鑒定出*（2019-ncov）毒株，該毒株在細(xì)胞培養(yǎng)中擴增迅速，可得到較高滴度的病毒；間接免疫熒光法發(fā)現(xiàn)病毒感染細(xì)胞顯示典型冠狀病毒樣病變-合胞體。目前，實驗室已基本完成該病毒株的全基因組序列測定和分析，與*（2019-ncov）參考基因組（epi_isl_402119, gisaid）相比，同源性大于99.9%。經(jīng)進一步純化、擴增和鑒定后，該毒株將為*疫苗、抗病毒的藥物研制和致病機理研究等提供重要的毒種資源[1]。
病毒毒株的定義與分離意義
病毒毒株是什么？
毒株是在實驗室條件下培養(yǎng)的病毒。就是病毒的原生體[2]
不管是對抗哪種病毒，都要進行科學(xué)檢測與實驗，而這些都需要把病毒毒株分離出來。有了毒株，才能進行動物實驗，臨床實驗，后面才能研發(fā)疫苗或相關(guān)藥物。
病毒毒株的分離有什么意義？
1、通過抗體檢測方法判斷和評估人群真實感染情況，對于了解病毒入侵人體的機制具有重要意義。
2、病毒毒株分離后，經(jīng)進一步純化、擴增和鑒定后，將為病毒疫苗、抗病毒的藥物研制和致病機理研究等提供重要的毒種資源。
3、可以用于開展制備疫苗的研究，這對未來預(yù)防疾病具有重要意義。
4、對選擇和制造*的治療藥物，診斷試劑的開發(fā)均具有重要意義。
作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，*的性狀、致病性、易感器官、致病機理、藥物敏感性以及流行規(guī)律都還不是很清楚，所以這次病毒的成功分離將為這些研究提供有力的病原學(xué)支撐。
簡單來說，有了這株毒株，相當(dāng)于我們在和病毒的戰(zhàn)爭中抓了一個俘虜。幫助我們識別它們，我們進行動物實驗，直接觀察病毒如何侵害機體器官，主要侵害哪些器官，會造成什么樣的癥狀，甚至推斷出在人體的致病模型，這些將是我們指導(dǎo)臨床治療的科學(xué)基礎(chǔ)。我們終戰(zhàn)勝病毒的武器之一。
分離并鑒定*毒株實驗流程圖
值得注意的是，不同于細(xì)菌，可以用瓊脂、肉湯等形成外部的營養(yǎng)環(huán)境，通過大規(guī)模的發(fā)酵和濃縮來進行制取; 病毒必須依靠宿主細(xì)胞中的資源來進行自身的復(fù)制、釋放完整病毒顆粒；因此它的分離擴增要通過細(xì)胞來進行培養(yǎng)。
免疫熒光技術(shù)——顯示病毒感染的細(xì)胞
間接免疫熒光法可以成功的發(fā)現(xiàn)分離出來的*肺炎病毒，其中關(guān)鍵設(shè)備之一為生物熒光顯微鏡。事實上，熒光顯微鏡早就廣泛用于呼吸道感染的快速臨床檢測。
免疫熒光技術(shù)（if）又稱免疫抗體技術(shù)，是一種以熒光素標(biāo)記抗體（抗原）而進行抗原（抗體）定位的技術(shù)。該技術(shù)無放射性污染，且操作簡便，特異性強、靈敏度高、檢測速度快，成為臨床檢驗中常用的檢驗手段之一。[3]
應(yīng)用廣泛的熒光素為異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothinocyanate，fitc），其在藍(lán)光的激發(fā)下呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光；是針對呼吸道疾病免疫熒光檢測用試劑的常用熒光素。目前臨床應(yīng)用比較廣泛的，是圍繞fitc染料的，美國的呼吸道七聯(lián)檢試劑盒和西班牙的九項igm抗體檢測試劑盒。
下面我們通過賞析一篇文獻來詳細(xì)看一下：
文獻賞析——通過蛋白冠狀構(gòu)造合成類病毒顆粒使冠狀病毒感染禽類模型的有效接種成為可能[4]
•hui-wen chen. department of veterinary medicine, national taiwan university, taipei, taiwan
•biomaterials volume 106, november 2016, pages 111-118 （2019 if: 10.273 ）
•文獻研究證明了一種簡單而可靠的方法來用合成納米顆粒連接病毒抗原; 改進疫苗應(yīng)用。
•使用熒光顯微鏡leica dmi8，進行成像，分析定量。
•染色：fitc標(biāo)記的抗小鼠igg (jackson immu- noresearch laboratories)孵育1小時。用dapi 復(fù)染。
這篇文獻涉及的對抗的冠狀病毒coronavirus有sars-cov和mers-cov，并非引發(fā)今次疫情的2019*（又稱嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型，sars-cov-2）。但它們同屬冠狀病毒亞科（coronavirus），是不同的變種。[5]
8周大balb/c小鼠通過爪墊內(nèi)（intra-footpad）注射50 ml pbs自由蛋白制劑，或含有2mg病毒抗原的svlps 。24 h后，處死小鼠和收割腘窩淋巴結(jié) (n ¼ 6). 制作冰凍切片(6 mm) (n¼6)。冰凍切片(6 mm)在丙酮中固定10min, 1%多聚甲醛中固定8min。切片用5%正常山羊血清pbs溶液阻斷10分鐘，并用anti-s mab 室溫下孵育4h。沖洗后，切片進一步在fitc標(biāo)記的抗小鼠igg（fitc-conjugated anti-mouse igg (jackson immuno research laboratories)）室溫下孵育1小時。細(xì)胞核用dapi染色，以顯示所有細(xì)胞。熒光信號在leica dmi8熒光顯微鏡(leica dmi8)下觀察，成像分析定量。[4]
svlps的抗原遞送和免疫原性：(a)腘窩淋巴結(jié)切片在明亮視野下(上圖)進行免疫熒光檢測(bottom panel). 淋巴結(jié)切片用dapi(藍(lán)色)和fitc標(biāo)記的anti-ibv spike蛋白抗體(綠色)染色，以檢測淋巴結(jié)內(nèi)抗原含量(b)抗原熒光信號的量化的淋巴結(jié)。bars represent means ± s.d. (n ¼ 6). (c)接種疫苗后14和21天，量化anti-ibv spike蛋白質(zhì)的免疫球蛋白濃度。[4]
實驗關(guān)鍵利器——熒光顯微鏡dmi8
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25mm 目鏡視野，19mm 成像視野， 保證更大的可視面積，單一視野更多觀察目標(biāo)；更易搜索目標(biāo)視野。
2、*技術(shù)——leica高精度
dmi8 系統(tǒng)的一大特色為以 20 nm 的重定位精度實現(xiàn)閉環(huán)調(diào)焦。在增大的 12 mm 調(diào)焦行程的基礎(chǔ)上，選擇閉環(huán)調(diào)焦，實現(xiàn)多點間歇攝取實驗的高再現(xiàn)性。
3、高穩(wěn)定性：*焦面保持 – 三重保障
afc——徠卡自適應(yīng)調(diào)焦控制
只需單擊一次按鈕，具有 led 光束輔助功能的徠卡自適應(yīng)調(diào)焦控制(afc) 即可自動實時維持對焦。
節(jié)省時間，確保您的間歇成像攝取不受實驗條件變化的影響。
小鼠胚胎發(fā)育（熒光標(biāo)記組蛋白變體h3.3）連續(xù)觀察32 h
4、看得更快 – 實驗速度加快5倍
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間歇攝取實驗時間可縮短5倍意味著您不但可以節(jié)省時間，還能獲得更多細(xì)節(jié)。不管實驗中使用了哪種儀器組件，系統(tǒng)都將以高可能的速度運行。
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升級來了——革新寬場成像：thunder系統(tǒng)
共聚焦的成像質(zhì)量，寬場的成像速度！
新品：高分辨高速多維成像系統(tǒng)thunder
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高清成像：
136nm光學(xué)分辨率 3d 樣品進行清晰成像
高速多維成像：
3.5分鐘內(nèi)完成96孔板z-stack多層掃描
2分鐘內(nèi)完成熒光玻片掃描
低光毒性：
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操作簡單：
一鍵成像，實時出圖
thunder imager –高分辨率
xy方向：136nm光學(xué)分辨率，比普通寬場2x提高
xz方向：264nm光學(xué)分辨率，比普通寬場2.5x提高
thunder imager –高速，多維實時成像
thunder是建立在寬場基礎(chǔ)上的，在高分辨率的同時，保留了寬場成像快速的優(yōu)勢。
單維度：每秒90幅2048*2048。
多維度：1920x1440像素，3通道，10層z，96孔板掃描，3分30秒以內(nèi)完成！
thunder imager –應(yīng)用廣泛
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z軸掃描平均深度：150um，三維重建示例。
thunder看得更多–觀察面積增大到10,000倍
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創(chuàng)建樣本的概覽圖，立即識別重要細(xì)節(jié)。然后使用載玻片、培養(yǎng)皿和多孔板模板，自動設(shè)置高分辨率圖像攝取。
thunder看得更準(zhǔn)確–找到您的答案
不管您關(guān)注的是哪種實驗，las x navigator 始終是 dmi8 s 平臺上通往所有應(yīng)用的關(guān)鍵。
生成實時概覽圖
創(chuàng)建螺旋掃描，搜索當(dāng)前位置的鄰近區(qū)域
在標(biāo)本夾模板中顯示圖像，進行快速定向
在相同工作空間中使用任何放大倍率、相機、檢測器和反差方法
定義高分辨率掃描或多孔板成像項目的無限多個區(qū)域和位置
快速縮放標(biāo)本
通過鼠標(biāo)單擊即可移動到載物臺上的任何位置
斑馬魚幼魚。來源：ravindra peravali, institute of toxicology and genetics, eggenstein-leopoldshafen, germany.
培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞，做59層z軸斷層掃描。綠色,beta-iii-tubulin;藍(lán)色,細(xì)胞核。
不僅僅可以觀察培養(yǎng)細(xì)胞，對類器官也有效果。
小鼠肺的類器官來源于肺泡莖和祖細(xì)胞。標(biāo)本厚度200um。使用徠卡thunder 3d live cell系統(tǒng)以及20x 干鏡，樣品放置于1mm厚度的普通塑料底12孔板內(nèi)。一樣可得出清晰超凡的三維斷層掃描效果。充分證明了thunder系統(tǒng)應(yīng)用廣泛的特點，不限物鏡！不限樣品器皿！
sample courtesy dr. pumaree kanrai, mpi for heart and lung research, bad nauheim (germany).
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