NY/T 3945-2021植物源性食品中游離態甾醇、結合態甾醇及總甾醇的測定
中華人民共和國農業行業標準
ny/t 3945-2021
植物源性食品中游離態甾醇、結合態甾醇及總甾醇的測定
氣相色譜串聯質譜法
determination of free，bound and total sterols in foods of plant origin
by gas chromatography-mass spectrometry
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020（標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。
本文件由農業農村部農產品質量安全監管司提出。
本文件由農業農村部農產品營養標準專家委員會歸口。
本文件起草單位：浙江大學、農業農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（杭州）。
本文件主要起草人：陸柏益、王蒙蒙、胡銀洲、楊博文、鐘永恒、徐濤。
1范圍
本文件規定了植物源性食品中游離態甾醇、結合態甾醇及總甾醇的測定方法。
本文件適用于植物源性食品中甾醇類化合物含量的測定。
2規范性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規范性引用而網成不這件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規格和試驗方法
3術語和定義
下列術語和定義適用于本文件。
3.1
植物源性食品foodg of plant origin
以植物的種子、果實或組織部分為原料，直接或加工以后為人類提供能量或物質來源的食品。
3.2
游離態甾醇free sterol
以游離狀態存在的甾醇
3.3
結合態甾醇bound sterol
以結合態存在的甾醇。
3. 4
總甾醇total sterol
以游離態和結合態有在的留醇的總和。
4原理
非食用油類樣品采用索氏抽提法提取油脂，油脂通過固相萃取分離得到游離態甾醇：油脂用氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，以二氯甲烷進行液液萃取分離得到總甾醇。以膽甾烷醇為內標，經氣相色譜分離、質譜檢測，得到總甾醇和游離態甾醇含量，兩者相減得到結合態甾醇含量。
5試劑和材料
5.1試劑
5.1.1正己烷（c6h14，cas號：110-54-3）：色譜純。
5.1.2正己烷（c6h14，cas號：110-54-3）。
5.1.3石油醚（c5h12，cas號：8032-32-4）：30℃~60℃沸程。
5.1.4乙醚（c4h10o，cas號：60-29-7）。
5.1.5乙醇（c2h6o，cas號：64-17-5）。
5.1.6丙酮（ch3coch3，cas號：67-64-1）：色譜純。
5.1.7二氯甲烷（ch2cl2，cas號：75-09-2）。
5.1.8無水硫酸鈉（na2so4，cas號：7757-82-6）。
5.1.9氫氧化鉀（koh，cas號：1310-58-3）。
5.1.10 n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺（c8h12f7nosi，cas號：53296-64-3）。
5.1.11 1-甲基咪唑（c4h6n2，cas號：616-47-7）。
5.1.12乙醚-正己烷溶液（10：90，v：v）：量取乙醚（5.1.4）10 ml，加入正己烷（5.1.2）90 ml，混勻，現用現配。
5.1. 13乙醚-正己烷溶液（20：80，v：v）：量取乙醚（5.1.4）20 ml，加入正己烷（5.1.2）80 ml，混勻，現用現配。
5.1.14氫氧化鉀乙醇溶液（2 mol/l）：稱取氫氧化鉀（5.1.9）11.2 g（精確至1 mg），10 ml水溶解，用乙醇（5.1.5）定容至100 ml，現用現配。
5.1.15硅烷化試劑：稱取n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺（5.1.10）950μl，加入1-甲基咪唑（5.1.11）50μl，現用現配。
5.2標準品
5.2. 1膽固醇（cholesterol，cas號：57-88-5），純度≥99%。
5.2.2膽甾烷醇（cholestanol，cas號：80-97-7），純度≥95%。
5.2.3菜籽甾醇（brassicasterol，cas號：474-67-9），純度≥95%。
5.2.4菜油甾醇（campesterol，cas號：474-62-4），純度≥95%。
5.2.5菜油甾烷醇（campestanol，cas號：474-60-2），純度≥95%。
5.2.6豆甾醇（stigmasterol，cas號：83-48- 7），純度≥95%。
5.2.7β-谷甾醇（β-sitosterol，cas號：83-46-5），純度≥95%。
5.2.8豆甾烷醇（stigmastanol，cas號：83- 45-4），純度≥95%。
5.2.9麥角甾醇（ergosterol，cas號：57-87-4），純度≥95%。
5.2.10標準混合儲備溶液（1000μg/ml）：準確稱取一定量的膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麥角甾醇和菜油甾烷醇標準品（精確至0.1mg），用丙酮（5.1.6）分別配制為1mg/ml的單標溶液。精確量取上述8種標準溶液各1 ml，用氮氣緩緩吹干溶劑，再用1 ml丙酮（5.1.6）復溶，配制成濃度1 mg/ml的標準混合儲備溶液。-18℃以下避光保存，保存期為3個月。
5.2.11標準中間工作液（100μg/ ml）：移取標準混合儲備溶液（5.2.10），以丙酮（5.1.6）為溶劑，配制成100μg/ml的標準中間工作液，現用現配。
5.2.12內標溶液：準確稱取膽角烷醇標準品，以丙酮（5.1.6）為溶劑，配制成濃度為200μg/ml的內標溶液。
5.3材料
5.3.1固相萃取柱：無鍵合硅膠填料固相萃取柱（500 mg/6 ml），或其他等效柱。
5.3.2反應瓶：容量1 ml，具螺紋瓶蓋和聚四氟乙烯（ptfe）線紋封口。
6儀器和設備
6.1氣相色譜串聯質譜儀：配電子轟擊電離源。
6.2分析天平：感量0.1 g、0.01 g和0.1 mg。
6.3渦旋振蕩器。
6.4離心機：轉速≥5000 r/min。
6.5組織搗碎機。
6.6固相萃取設備：要求能夠控制活化、上樣、淋洗和洗脫的速度。
6.7超聲波清洗器：功率≥500 w.
6.8索氏抽提器。
6.9氮氣吹干儀：要求能夠控制溫度，30℃~100℃。
6.10恒溫箱：0℃~150℃。
6.11恒溫水浴搖床：要求能夠控制溫度和轉速，30℃~99.9℃，0 r/min~200 r/min。
7樣品制備
取谷類、油料作物、堅果等樣品約100g，粉碎后充分混勻，放入密封袋中。取新鮮的蔬菜和水果可食部約200 g，將其切碎，充分混勻，放入組織搗碎機中搗碎成勻漿，放入聚乙烯瓶中。植物油等攪拌均勻，放入聚乙烯瓶中。
8試驗步驟
8.1油脂提取
8.1. 1試樣處理
a）固體試樣：稱取充分混勻后的試樣5 g~10 g，精確至0.01 g，全部移入濾紙簡內。
b）液體或半固體試樣：植物油類樣品直接按照8.2操作。其他液體或半固體試樣混勻后，稱取50 g~100 g，精確至0.1 g，置于蒸發皿中，加入石英砂約20 g，于沸水浴上蒸干后，在電熱鼓風干燥箱中于（100±5）℃干燥30 min~ 60 min后，取出，研細，全部移入濾紙筒內。蒸發皿及粘有試樣的玻璃棒，均用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，并將棉花放入濾紙筒內。
8.1.2提取
將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內，連接干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶內容積的2/3處，于水浴上加熱，使石油醚不斷回流抽提（6次/h~8次/h），一般抽提6 h~10h。提取結束時，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上無油斑表明提取完畢。
8.1.3稱量
取下接收瓶，回收石油醚，待接收瓶中溶劑剩余1 ml~2 ml時在水浴上蒸干，再于（100±5）℃干燥1 h，放入干燥器內冷卻0.5 h后稱量。重復以上操作直至恒重（直至2次稱量的差不超過2 mg）。
8.2甾醇的提取與凈化
8.2.1游離態甾醇的提取與凈化
定量稱取油樣提取液（8.1）50 mg（精確至0.1 mg）于離心管中，加入內標溶液（5.2.12）100μl后用正己烷（5.1.2）5 ml溶解，渦旋振蕩均勻。稱取無水硫酸鈉（5.1.8）1.0 g加到固相萃取柱（5.3.1）的上方，用正己烷（5.1.2）10 ml活化，流速1 ml/min，棄去流出液：將備用液5 ml全部過柱，流速1 ml/min，棄去流出液：用乙醚-正己烷溶液（5.1.12）10 mi淋洗，流速1 ml/min，棄去流出液：用乙醚-正己烷溶液（5.1.13）10 ml洗脫，流速1 ml/min，洗脫液收集于離心管中，40℃~50℃水浴條件下氮吹，剩余約1ml停止，轉移到反應瓶（5.3.2）中備用。
8.2.2總甾醇的提取與凈化
定量稱取油樣提取液（8.1）50 mg（精確至0.1 mg）于離心管中，加入內標溶液（5.2.12）100μl，再加入氫氧化鉀乙醇溶液（5.1.14）4 ml、二氯甲烷（5.1.7）0.5 ml，渦旋混勻后，（25±5）℃搖床水浴18 h，轉速（40±5）r/min。加入二氯甲烷（5.1.7）5 ml、水3 ml，輕輕混勻，3 000 r/ min離心5 min，除去上層水相，有機相分別用水5ml洗滌3次，至下層溶液澄清。將所得有機相于40℃~50℃水浴條件下氮吹，剩余約1 ml時停止，轉移到反應瓶（5.3.2）中備用。
8.3甾醇三甲基硅醚的制備
在40℃條件下氮氣緩緩吹干反應瓶（8.2.1或8.2.2）中的溶劑，再加入硅烷化試劑（5.1.15）100μl，旋緊反應瓶蓋，放于75℃的恒溫箱中反應20 min，冷卻至室溫，加入正己烷（5.1.1）復溶至1 ml，供氣相色譜串聯質譜儀檢測。
8.4測定
8.4.1氣相色譜參考條件
a）載氣：氦氣（純度99.999%）：
b）色譜柱：db-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）或等效柱：
c）進樣口溫度為290℃：進樣方式為不分流進樣：進樣量為1μl：流速為1.2 ml/min：
d）程序升溫：初始溫度100℃（保持1 min），以50℃/min升至220℃，以5℃/min升至290℃
（保持15 min）。
8.4.2質譜參考條件
a）電離能量：70 ev：
b）電離方式：ei：
c）離子源溫度：250℃：
d）傳輸線溫度：2900：
e）監測方式：sim模式：
f）檢測離子對見附錄b。
8.4.3定性測定
用氣相色譜串聯質譜儀測定衍生完畢的試樣（8.3）記錄總離子流圖和質譜圖。在相同實驗條件下，通過標準品的保留時間和對應質譜圖進定性。
8.4.4定量測定
8.4.4.1甾醇相對響應因子的測定
準確量取標準中間工作液（5.2.11）適量，用丙酮逐級稀釋成含各甾醇濃度分別為0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的系列混合工作液，從中各取1 ml到反應瓶（5.3.2）中，加入內標溶液（5.2.12）100μl，按照8.3衍生后，測定膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麥角甾醇和菜油甾烷醇三甲基硅醚的峰面積。結合內際物的已知含量，分別計算膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麥角甾醇和菜油甾烷醇三甲基硅醚與膽甾烷醇三甲基硅醚（內標）的相對響應因子（具體見9.2），以3次測定的平均值表示，用于后續定量。
8.4.4.2樣品溶液的測定
用氣相色譜串聯質譜儀測定衍生后的試樣（8.3），分別測定各甾醇三甲基硅醚在規定提取離子條件下的峰面積，獨立平行測足3次，不同甾醇三甲基硅醚的定量離子組合見附錄a，不聽甾醇三甲基硅醚的色譜圖參見附錄b。
9結果表示
9.1試樣中油脂含量的計算
試樣中油脂含量按公式（1）計算，
式中：
?——試樣中油脂的含量的數值，單位為毫克每克（mg/g）：
m0——接收瓶質量的數值，單位為克（g）：
m1——恒重后接收瓶和脂肪的質量的數值，單位為克（g）：
m——試樣的質量的數值，單位為克（g）：
1 000——換算系數。
9.2相對響應因子的計算
甾醇相對響應因子按公式（2）計算。
式中：
fi——甾醇與膽甾烷醇三甲基硅醚（內標）的相對響應因子的數值，其中f1、f3、f4、f5、f6、f7、f8、f9分別代表標準溶液中的膽固醇、菜籽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的相對響應因子：
ai，s——內標或甾醇峰面積的數值，其中a0，s、a1，s、a3，s、a4，s、a5，s、a6，s、a7，s、a8，s、a9，s分別代表標準溶液中的膽甾烷醇（內標）、膽固醇、菜籽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的峰面積：
ci，s——標準溶液中甾醇的含量的數值，其中c0，s、c1，s、c3，s、c4，s、c5，s、c6，s、c7，s、c8，s、c9，s分別代表標準溶液中的膽甾烷醇（內標）、膽固醇、菜籽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的含量的數值，單位為微克每毫升（μg/ml）。
9.3試樣中甾醇的計算
采用內標法對試樣中游離態甾醇和總甾醇進行定量分析，各甾醇含量按公式（3）計算。
式中：
ci——試樣中各游離甾醇或總甾醇含量的數值，單位為毫克每千克（mg/kg）：
m0——內標膽甾烷醇質量的數值，為0.02mg：
m——稱取油脂質量的數值，單位為毫克（mg）：
ai——試樣中各甾醇三甲基醚峰面積的數值：
a0——-試樣中膽甾烷醇三甲基醚峰面積的數值：
?——油脂含量的數值，單位為毫克每克（mg/g）：
1 000——換算系數。
結合態甾醇含量為c結合=c總- c游離。
計算結果以重復性條件下獲得的2次獨立測定結果的算術平均值表示，植物油和固體試樣結果保留小數點后1位，其他液體和半固體樣品結果保留小數點后2位。
10精密度
10.1重復性
在重復性條件下獲得的2次獨立的測試結果的絕對差值不大于這2個測定值的算術平均值的20%。
10.2再現性
在再現性條件下獲得的2次獨立的測試結果的絕對差值不大于這2個測定值的算術平均值的20%。
11其他
本方法植物油中各甾醇檢出限為2 mg/ kg，定量限為10 mg/kg：谷類中各甾醇檢出限為0.02 mg/kg，定量限為0.1mg/kg：油料作物、堅果中各甾醇檢出限為1mg/kg，定量限為5mg/kg：蔬菜和水果中各甾醇檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.01 mg/kg。
操作龍門磨床時的注意事項
配電隔離器的工作原理
湖南消防離心風機的磨損及停機現象
FPV型氧氣管道阻火器的保養
回收鈦材MVR廢水蒸發器
NY/T 3945-2021植物源性食品中游離態甾醇、結合態甾醇及總甾醇的測定
GST-瓊脂糖凝膠4B預裝柱使用說明
不銹鋼高壓反應釜夾套加熱原理
諾基亞貝爾與中國電信簽署人工智能戰略合作協議
等離子清洗機在生物醫療領域的應用
尾礦提金樹脂分類說明簡介
全自動新款仿手工餃子機來了有心動的嗎
大米食味計為食品安全體系建立奠定了基礎
測力儀的使用方法
HOG10DN1024ILR16H7KLK-AX現貨
精密數控車床操作中的流程
數控機床刀柄系統的選擇
高壓滅菌器故障排查和解決方法
小型高低溫試驗機全封閉式壓縮機電動機怎么維修?
國標DYE-300水泥抗壓試驗機
ny/t 3945-2021
植物源性食品中游離態甾醇、結合態甾醇及總甾醇的測定
氣相色譜串聯質譜法
determination of free，bound and total sterols in foods of plant origin
by gas chromatography-mass spectrometry
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020（標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。
本文件由農業農村部農產品質量安全監管司提出。
本文件由農業農村部農產品營養標準專家委員會歸口。
本文件起草單位：浙江大學、農業農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（杭州）。
本文件主要起草人：陸柏益、王蒙蒙、胡銀洲、楊博文、鐘永恒、徐濤。
1范圍
本文件規定了植物源性食品中游離態甾醇、結合態甾醇及總甾醇的測定方法。
本文件適用于植物源性食品中甾醇類化合物含量的測定。
2規范性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規范性引用而網成不這件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規格和試驗方法
3術語和定義
下列術語和定義適用于本文件。
3.1
植物源性食品foodg of plant origin
以植物的種子、果實或組織部分為原料，直接或加工以后為人類提供能量或物質來源的食品。
3.2
游離態甾醇free sterol
以游離狀態存在的甾醇
3.3
結合態甾醇bound sterol
以結合態存在的甾醇。
3. 4
總甾醇total sterol
以游離態和結合態有在的留醇的總和。
4原理
非食用油類樣品采用索氏抽提法提取油脂，油脂通過固相萃取分離得到游離態甾醇：油脂用氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，以二氯甲烷進行液液萃取分離得到總甾醇。以膽甾烷醇為內標，經氣相色譜分離、質譜檢測，得到總甾醇和游離態甾醇含量，兩者相減得到結合態甾醇含量。
5試劑和材料
5.1試劑
5.1.1正己烷（c6h14，cas號：110-54-3）：色譜純。
5.1.2正己烷（c6h14，cas號：110-54-3）。
5.1.3石油醚（c5h12，cas號：8032-32-4）：30℃~60℃沸程。
5.1.4乙醚（c4h10o，cas號：60-29-7）。
5.1.5乙醇（c2h6o，cas號：64-17-5）。
5.1.6丙酮（ch3coch3，cas號：67-64-1）：色譜純。
5.1.7二氯甲烷（ch2cl2，cas號：75-09-2）。
5.1.8無水硫酸鈉（na2so4，cas號：7757-82-6）。
5.1.9氫氧化鉀（koh，cas號：1310-58-3）。
5.1.10 n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺（c8h12f7nosi，cas號：53296-64-3）。
5.1.11 1-甲基咪唑（c4h6n2，cas號：616-47-7）。
5.1.12乙醚-正己烷溶液（10：90，v：v）：量取乙醚（5.1.4）10 ml，加入正己烷（5.1.2）90 ml，混勻，現用現配。
5.1. 13乙醚-正己烷溶液（20：80，v：v）：量取乙醚（5.1.4）20 ml，加入正己烷（5.1.2）80 ml，混勻，現用現配。
5.1.14氫氧化鉀乙醇溶液（2 mol/l）：稱取氫氧化鉀（5.1.9）11.2 g（精確至1 mg），10 ml水溶解，用乙醇（5.1.5）定容至100 ml，現用現配。
5.1.15硅烷化試劑：稱取n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺（5.1.10）950μl，加入1-甲基咪唑（5.1.11）50μl，現用現配。
5.2標準品
5.2. 1膽固醇（cholesterol，cas號：57-88-5），純度≥99%。
5.2.2膽甾烷醇（cholestanol，cas號：80-97-7），純度≥95%。
5.2.3菜籽甾醇（brassicasterol，cas號：474-67-9），純度≥95%。
5.2.4菜油甾醇（campesterol，cas號：474-62-4），純度≥95%。
5.2.5菜油甾烷醇（campestanol，cas號：474-60-2），純度≥95%。
5.2.6豆甾醇（stigmasterol，cas號：83-48- 7），純度≥95%。
5.2.7β-谷甾醇（β-sitosterol，cas號：83-46-5），純度≥95%。
5.2.8豆甾烷醇（stigmastanol，cas號：83- 45-4），純度≥95%。
5.2.9麥角甾醇（ergosterol，cas號：57-87-4），純度≥95%。
5.2.10標準混合儲備溶液（1000μg/ml）：準確稱取一定量的膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麥角甾醇和菜油甾烷醇標準品（精確至0.1mg），用丙酮（5.1.6）分別配制為1mg/ml的單標溶液。精確量取上述8種標準溶液各1 ml，用氮氣緩緩吹干溶劑，再用1 ml丙酮（5.1.6）復溶，配制成濃度1 mg/ml的標準混合儲備溶液。-18℃以下避光保存，保存期為3個月。
5.2.11標準中間工作液（100μg/ ml）：移取標準混合儲備溶液（5.2.10），以丙酮（5.1.6）為溶劑，配制成100μg/ml的標準中間工作液，現用現配。
5.2.12內標溶液：準確稱取膽角烷醇標準品，以丙酮（5.1.6）為溶劑，配制成濃度為200μg/ml的內標溶液。
5.3材料
5.3.1固相萃取柱：無鍵合硅膠填料固相萃取柱（500 mg/6 ml），或其他等效柱。
5.3.2反應瓶：容量1 ml，具螺紋瓶蓋和聚四氟乙烯（ptfe）線紋封口。
6儀器和設備
6.1氣相色譜串聯質譜儀：配電子轟擊電離源。
6.2分析天平：感量0.1 g、0.01 g和0.1 mg。
6.3渦旋振蕩器。
6.4離心機：轉速≥5000 r/min。
6.5組織搗碎機。
6.6固相萃取設備：要求能夠控制活化、上樣、淋洗和洗脫的速度。
6.7超聲波清洗器：功率≥500 w.
6.8索氏抽提器。
6.9氮氣吹干儀：要求能夠控制溫度，30℃~100℃。
6.10恒溫箱：0℃~150℃。
6.11恒溫水浴搖床：要求能夠控制溫度和轉速，30℃~99.9℃，0 r/min~200 r/min。
7樣品制備
取谷類、油料作物、堅果等樣品約100g，粉碎后充分混勻，放入密封袋中。取新鮮的蔬菜和水果可食部約200 g，將其切碎，充分混勻，放入組織搗碎機中搗碎成勻漿，放入聚乙烯瓶中。植物油等攪拌均勻，放入聚乙烯瓶中。
8試驗步驟
8.1油脂提取
8.1. 1試樣處理
a）固體試樣：稱取充分混勻后的試樣5 g~10 g，精確至0.01 g，全部移入濾紙簡內。
b）液體或半固體試樣：植物油類樣品直接按照8.2操作。其他液體或半固體試樣混勻后，稱取50 g~100 g，精確至0.1 g，置于蒸發皿中，加入石英砂約20 g，于沸水浴上蒸干后，在電熱鼓風干燥箱中于（100±5）℃干燥30 min~ 60 min后，取出，研細，全部移入濾紙筒內。蒸發皿及粘有試樣的玻璃棒，均用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，并將棉花放入濾紙筒內。
8.1.2提取
將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內，連接干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶內容積的2/3處，于水浴上加熱，使石油醚不斷回流抽提（6次/h~8次/h），一般抽提6 h~10h。提取結束時，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上無油斑表明提取完畢。
8.1.3稱量
取下接收瓶，回收石油醚，待接收瓶中溶劑剩余1 ml~2 ml時在水浴上蒸干，再于（100±5）℃干燥1 h，放入干燥器內冷卻0.5 h后稱量。重復以上操作直至恒重（直至2次稱量的差不超過2 mg）。
8.2甾醇的提取與凈化
8.2.1游離態甾醇的提取與凈化
定量稱取油樣提取液（8.1）50 mg（精確至0.1 mg）于離心管中，加入內標溶液（5.2.12）100μl后用正己烷（5.1.2）5 ml溶解，渦旋振蕩均勻。稱取無水硫酸鈉（5.1.8）1.0 g加到固相萃取柱（5.3.1）的上方，用正己烷（5.1.2）10 ml活化，流速1 ml/min，棄去流出液：將備用液5 ml全部過柱，流速1 ml/min，棄去流出液：用乙醚-正己烷溶液（5.1.12）10 mi淋洗，流速1 ml/min，棄去流出液：用乙醚-正己烷溶液（5.1.13）10 ml洗脫，流速1 ml/min，洗脫液收集于離心管中，40℃~50℃水浴條件下氮吹，剩余約1ml停止，轉移到反應瓶（5.3.2）中備用。
8.2.2總甾醇的提取與凈化
定量稱取油樣提取液（8.1）50 mg（精確至0.1 mg）于離心管中，加入內標溶液（5.2.12）100μl，再加入氫氧化鉀乙醇溶液（5.1.14）4 ml、二氯甲烷（5.1.7）0.5 ml，渦旋混勻后，（25±5）℃搖床水浴18 h，轉速（40±5）r/min。加入二氯甲烷（5.1.7）5 ml、水3 ml，輕輕混勻，3 000 r/ min離心5 min，除去上層水相，有機相分別用水5ml洗滌3次，至下層溶液澄清。將所得有機相于40℃~50℃水浴條件下氮吹，剩余約1 ml時停止，轉移到反應瓶（5.3.2）中備用。
8.3甾醇三甲基硅醚的制備
在40℃條件下氮氣緩緩吹干反應瓶（8.2.1或8.2.2）中的溶劑，再加入硅烷化試劑（5.1.15）100μl，旋緊反應瓶蓋，放于75℃的恒溫箱中反應20 min，冷卻至室溫，加入正己烷（5.1.1）復溶至1 ml，供氣相色譜串聯質譜儀檢測。
8.4測定
8.4.1氣相色譜參考條件
a）載氣：氦氣（純度99.999%）：
b）色譜柱：db-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）或等效柱：
c）進樣口溫度為290℃：進樣方式為不分流進樣：進樣量為1μl：流速為1.2 ml/min：
d）程序升溫：初始溫度100℃（保持1 min），以50℃/min升至220℃，以5℃/min升至290℃
（保持15 min）。
8.4.2質譜參考條件
a）電離能量：70 ev：
b）電離方式：ei：
c）離子源溫度：250℃：
d）傳輸線溫度：2900：
e）監測方式：sim模式：
f）檢測離子對見附錄b。
8.4.3定性測定
用氣相色譜串聯質譜儀測定衍生完畢的試樣（8.3）記錄總離子流圖和質譜圖。在相同實驗條件下，通過標準品的保留時間和對應質譜圖進定性。
8.4.4定量測定
8.4.4.1甾醇相對響應因子的測定
準確量取標準中間工作液（5.2.11）適量，用丙酮逐級稀釋成含各甾醇濃度分別為0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的系列混合工作液，從中各取1 ml到反應瓶（5.3.2）中，加入內標溶液（5.2.12）100μl，按照8.3衍生后，測定膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麥角甾醇和菜油甾烷醇三甲基硅醚的峰面積。結合內際物的已知含量，分別計算膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麥角甾醇和菜油甾烷醇三甲基硅醚與膽甾烷醇三甲基硅醚（內標）的相對響應因子（具體見9.2），以3次測定的平均值表示，用于后續定量。
8.4.4.2樣品溶液的測定
用氣相色譜串聯質譜儀測定衍生后的試樣（8.3），分別測定各甾醇三甲基硅醚在規定提取離子條件下的峰面積，獨立平行測足3次，不同甾醇三甲基硅醚的定量離子組合見附錄a，不聽甾醇三甲基硅醚的色譜圖參見附錄b。
9結果表示
9.1試樣中油脂含量的計算
試樣中油脂含量按公式（1）計算，
式中：
?——試樣中油脂的含量的數值，單位為毫克每克（mg/g）：
m0——接收瓶質量的數值，單位為克（g）：
m1——恒重后接收瓶和脂肪的質量的數值，單位為克（g）：
m——試樣的質量的數值，單位為克（g）：
1 000——換算系數。
9.2相對響應因子的計算
甾醇相對響應因子按公式（2）計算。
式中：
fi——甾醇與膽甾烷醇三甲基硅醚（內標）的相對響應因子的數值，其中f1、f3、f4、f5、f6、f7、f8、f9分別代表標準溶液中的膽固醇、菜籽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的相對響應因子：
ai，s——內標或甾醇峰面積的數值，其中a0，s、a1，s、a3，s、a4，s、a5，s、a6，s、a7，s、a8，s、a9，s分別代表標準溶液中的膽甾烷醇（內標）、膽固醇、菜籽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的峰面積：
ci，s——標準溶液中甾醇的含量的數值，其中c0，s、c1，s、c3，s、c4，s、c5，s、c6，s、c7，s、c8，s、c9，s分別代表標準溶液中的膽甾烷醇（內標）、膽固醇、菜籽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的含量的數值，單位為微克每毫升（μg/ml）。
9.3試樣中甾醇的計算
采用內標法對試樣中游離態甾醇和總甾醇進行定量分析，各甾醇含量按公式（3）計算。
式中：
ci——試樣中各游離甾醇或總甾醇含量的數值，單位為毫克每千克（mg/kg）：
m0——內標膽甾烷醇質量的數值，為0.02mg：
m——稱取油脂質量的數值，單位為毫克（mg）：
ai——試樣中各甾醇三甲基醚峰面積的數值：
a0——-試樣中膽甾烷醇三甲基醚峰面積的數值：
?——油脂含量的數值，單位為毫克每克（mg/g）：
1 000——換算系數。
結合態甾醇含量為c結合=c總- c游離。
計算結果以重復性條件下獲得的2次獨立測定結果的算術平均值表示，植物油和固體試樣結果保留小數點后1位，其他液體和半固體樣品結果保留小數點后2位。
10精密度
10.1重復性
在重復性條件下獲得的2次獨立的測試結果的絕對差值不大于這2個測定值的算術平均值的20%。
10.2再現性
在再現性條件下獲得的2次獨立的測試結果的絕對差值不大于這2個測定值的算術平均值的20%。
11其他
本方法植物油中各甾醇檢出限為2 mg/ kg，定量限為10 mg/kg：谷類中各甾醇檢出限為0.02 mg/kg，定量限為0.1mg/kg：油料作物、堅果中各甾醇檢出限為1mg/kg，定量限為5mg/kg：蔬菜和水果中各甾醇檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.01 mg/kg。
操作龍門磨床時的注意事項
配電隔離器的工作原理
湖南消防離心風機的磨損及停機現象
FPV型氧氣管道阻火器的保養
回收鈦材MVR廢水蒸發器
NY/T 3945-2021植物源性食品中游離態甾醇、結合態甾醇及總甾醇的測定
GST-瓊脂糖凝膠4B預裝柱使用說明
不銹鋼高壓反應釜夾套加熱原理
諾基亞貝爾與中國電信簽署人工智能戰略合作協議
等離子清洗機在生物醫療領域的應用
尾礦提金樹脂分類說明簡介
全自動新款仿手工餃子機來了有心動的嗎
大米食味計為食品安全體系建立奠定了基礎
測力儀的使用方法
HOG10DN1024ILR16H7KLK-AX現貨
精密數控車床操作中的流程
數控機床刀柄系統的選擇
高壓滅菌器故障排查和解決方法
小型高低溫試驗機全封閉式壓縮機電動機怎么維修?
國標DYE-300水泥抗壓試驗機