GB 31656.11-2021水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb 31656.11-2021
代替gb/t 22961-2008
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定
national food safety standard-
determination of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline
and doxycycline residues in aquatic products
前言
本文件按照gb/t1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件代替gb/t 22961-2008，并增加液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本文件方法一對gb/t 22961-2008《河豚魚、鰻魚中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法》進(jìn)行修訂。本文件與gb/t 22961-2008相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)內(nèi)容變化如下：
——更改了標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍（見1、2008年版的1）；
——更改了方法的檢測器，由紫外檢測器改為熒光檢測器（見6.1、2008年版的5.1）；
——更改了方法的部分測定步驟和檢出限（見8、2008年版的7）。
本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：
——gb/t 22961-2008；
——本次為第一次修訂。
1范圍
本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量測定的高效液相色譜法。
本文件適用于魚、蝦、蟹、鱉及海參等水產(chǎn)品可食組織中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可（ke）少的條款。其中注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 30891-2014水產(chǎn)品抽樣規(guī)范
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
試樣中土霉素，四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素經(jīng)檸檬酸緩沖液提取后，固相萃取柱凈化，液相色譜熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。
5試劑與材料
以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純；水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1試劑
5.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.1.2乙酸鎂（c4h6o4mg·4h20）。
5.1.3咪唑（c3h4n2）。
5.1.4磷酸二氫鉀（kh2po4）。
5.1.5檸檬酸（c9h8o7•h2o）：優(yōu)級純。
5.1.6磷酸氫二鈉（na2hpo4）：優(yōu)級純。
5.1.7乙二胺四乙酸二鈉（na2edta•2h2o）：優(yōu)級純。
5.1.8冰乙酸（ch3cooh）。
5.2溶液配制
5.2.1磷酸二氫鉀溶液：取磷酸二氫鉀13.6g，加水適量使溶解并稀釋至1000ml。
5.2.2甲醇溶液：取甲醇5 ml、水95 ml，混勻。
5.2.3檸檬酸緩沖液：取檸檬酸6.30g、磷酸氫二鈉13.8g、乙二胺四乙酸二鈉1.86g，加水400ml使溶解，用冰乙酸調(diào)ph至4.0，再用水稀釋至500 ml。
5.2.4咪唑緩沖溶液：取咪唑68.0g、乙二胺四乙酸二鈉0.40g、乙酸鎂10.0g，加水800ml使溶解，用冰乙酸調(diào)ph至7.2，再用水稀釋至1 000 ml，經(jīng)0. 45μm水相微孔濾膜過濾后備用。
5.2.5甲醇咪唑緩沖溶液：取甲醇20 ml、咪唑緩沖溶液80 ml，混勻。
5.3標(biāo)準(zhǔn)品
鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸多西環(huán)素，含量均≥95%，具體見附錄a。
5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液制備
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/ml）：分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解稀釋定容配制成土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素濃度均為100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-18℃以下避光儲存，有效期1個月。
5.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確移取土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 ml、1.0 ml、2.0ml和2.0ml于100ml容量瓶，用甲醇稀釋并定容，配制成土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素濃度分別為1.0μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和2.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。-18℃以下避光儲存，有效期為7 d。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：500 mg/6 ml，oasis hlb或性能相當(dāng)者。
5.5.2水相微孔濾膜：0. 22μm。
6儀器和設(shè)備
6.1高效液相色譜儀：配熒光檢測器。
6.2分析天平：感量0.01 g。
6.3分析天平：感量0.00001 g。
6.4渦旋振蕩器。
6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速6 000 r/min或以上。
6.6固相萃取裝置（帶負(fù)壓抽濾器）。
6.7氮吹儀。
6.8組織勻漿機(jī)。
7試樣的制備與保存
7.1試樣的制備
按gb/t 30891-2014附錄b的要求制樣。
a）取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試樣；
b）取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試樣；
c）取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試樣。
7.2試樣的保存
-18℃以下保存。
8測定步驟
8.1提取
取試樣5g（準(zhǔn)確至±0.05g），加檸檬酸緩沖液20ml，渦旋震蕩2min，超聲提取10min，以6000r/min離心10 min，取上清液于另一50 ml離心管中。向殘渣加檸檬酸緩沖液10 ml，重復(fù)提取2次，合并3次上清液，待凈化。
8.2凈化
將oasis hlb固相萃取柱依次用甲醇10 ml、水10 ml、檸檬酸緩沖液5 ml活化，移入待凈化液，用甲醇溶液10ml，水10ml淋洗，抽干，加甲醇10ml洗脫，收集洗脫液，40c氮?dú)獯蹈桑恿姿岫溻浫芤?.0 ml溶解殘渣，超聲1min，過0.22μm水相微孔濾膜后，供高效液相色譜測定。
8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
準(zhǔn)確移取土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用甲醇咪唑緩沖溶液稀釋成土霉素和四環(huán)素濃度分別為50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml，金霉素和多西環(huán)素濃度分別為100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、1 000 ng/ml、2 000 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液供高效液相色譜測定。以待測物峰面積為縱坐標(biāo)、相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
8.4測定
8.4.1液相色譜參考條件
a）色譜柱：c18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），或相當(dāng)者；
b）柱溫：40℃；
c）進(jìn)樣量：30μl；
d）流速：0.8 ml/min；
e）激發(fā)波長：380 nm；
f）發(fā)射波長：520 nm；
g）流動相：甲醇-咪唑緩沖溶液。
8.4.2測定法
取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰面積定量，外標(biāo)法計算。標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖見附錄b中的圖b. 1。
8.5空白試驗
取空白試料，除不加標(biāo)準(zhǔn)溶液外，采用相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。
9結(jié)果計算和表述
試樣中待測物殘留量按標(biāo)準(zhǔn)曲線或公式（1）計算。
式中：
x——試樣中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素含量的數(shù)值，單位為微克每千克（μg/kg）；
a——試樣中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的峰面積；
as——標(biāo)準(zhǔn)溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的峰面積；
cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素濃度的數(shù)值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v——最終試樣定容體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——供試試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
10檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度
10. 1靈敏度
本方法在水產(chǎn)品可食組織中土霉素和四環(huán)素的檢測限均為10.0μg/kg，多西環(huán)素和金霉素的檢測限均為20.0μg/kg；土霉素和四環(huán)素的定量限均為20.0μg/kg，多西環(huán)素和金霉素定量限均為40.0μg/kg。
10.2準(zhǔn)確度
土霉素和四環(huán)素在20.0μg/kg~200μg/kg添加濃度的回收率為60%~110%；多西環(huán)素和金霉素在40.0μg/kg~ 400μg/kg添加濃度的回收率為60%~110%。
10.3精密度
本方法的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%。
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gb 31656.11-2021
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水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定
national food safety standard-
determination of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline
and doxycycline residues in aquatic products
前言
本文件按照gb/t1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件代替gb/t 22961-2008，并增加液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本文件方法一對gb/t 22961-2008《河豚魚、鰻魚中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法》進(jìn)行修訂。本文件與gb/t 22961-2008相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)內(nèi)容變化如下：
——更改了標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍（見1、2008年版的1）；
——更改了方法的檢測器，由紫外檢測器改為熒光檢測器（見6.1、2008年版的5.1）；
——更改了方法的部分測定步驟和檢出限（見8、2008年版的7）。
本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：
——gb/t 22961-2008；
——本次為第一次修訂。
1范圍
本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量測定的高效液相色譜法。
本文件適用于魚、蝦、蟹、鱉及海參等水產(chǎn)品可食組織中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可（ke）少的條款。其中注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 30891-2014水產(chǎn)品抽樣規(guī)范
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
試樣中土霉素，四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素經(jīng)檸檬酸緩沖液提取后，固相萃取柱凈化，液相色譜熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。
5試劑與材料
以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純；水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1試劑
5.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.1.2乙酸鎂（c4h6o4mg·4h20）。
5.1.3咪唑（c3h4n2）。
5.1.4磷酸二氫鉀（kh2po4）。
5.1.5檸檬酸（c9h8o7•h2o）：優(yōu)級純。
5.1.6磷酸氫二鈉（na2hpo4）：優(yōu)級純。
5.1.7乙二胺四乙酸二鈉（na2edta•2h2o）：優(yōu)級純。
5.1.8冰乙酸（ch3cooh）。
5.2溶液配制
5.2.1磷酸二氫鉀溶液：取磷酸二氫鉀13.6g，加水適量使溶解并稀釋至1000ml。
5.2.2甲醇溶液：取甲醇5 ml、水95 ml，混勻。
5.2.3檸檬酸緩沖液：取檸檬酸6.30g、磷酸氫二鈉13.8g、乙二胺四乙酸二鈉1.86g，加水400ml使溶解，用冰乙酸調(diào)ph至4.0，再用水稀釋至500 ml。
5.2.4咪唑緩沖溶液：取咪唑68.0g、乙二胺四乙酸二鈉0.40g、乙酸鎂10.0g，加水800ml使溶解，用冰乙酸調(diào)ph至7.2，再用水稀釋至1 000 ml，經(jīng)0. 45μm水相微孔濾膜過濾后備用。
5.2.5甲醇咪唑緩沖溶液：取甲醇20 ml、咪唑緩沖溶液80 ml，混勻。
5.3標(biāo)準(zhǔn)品
鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸多西環(huán)素，含量均≥95%，具體見附錄a。
5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液制備
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/ml）：分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解稀釋定容配制成土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素濃度均為100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-18℃以下避光儲存，有效期1個月。
5.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確移取土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 ml、1.0 ml、2.0ml和2.0ml于100ml容量瓶，用甲醇稀釋并定容，配制成土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素濃度分別為1.0μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和2.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。-18℃以下避光儲存，有效期為7 d。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：500 mg/6 ml，oasis hlb或性能相當(dāng)者。
5.5.2水相微孔濾膜：0. 22μm。
6儀器和設(shè)備
6.1高效液相色譜儀：配熒光檢測器。
6.2分析天平：感量0.01 g。
6.3分析天平：感量0.00001 g。
6.4渦旋振蕩器。
6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速6 000 r/min或以上。
6.6固相萃取裝置（帶負(fù)壓抽濾器）。
6.7氮吹儀。
6.8組織勻漿機(jī)。
7試樣的制備與保存
7.1試樣的制備
按gb/t 30891-2014附錄b的要求制樣。
a）取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試樣；
b）取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試樣；
c）取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試樣。
7.2試樣的保存
-18℃以下保存。
8測定步驟
8.1提取
取試樣5g（準(zhǔn)確至±0.05g），加檸檬酸緩沖液20ml，渦旋震蕩2min，超聲提取10min，以6000r/min離心10 min，取上清液于另一50 ml離心管中。向殘渣加檸檬酸緩沖液10 ml，重復(fù)提取2次，合并3次上清液，待凈化。
8.2凈化
將oasis hlb固相萃取柱依次用甲醇10 ml、水10 ml、檸檬酸緩沖液5 ml活化，移入待凈化液，用甲醇溶液10ml，水10ml淋洗，抽干，加甲醇10ml洗脫，收集洗脫液，40c氮?dú)獯蹈桑恿姿岫溻浫芤?.0 ml溶解殘渣，超聲1min，過0.22μm水相微孔濾膜后，供高效液相色譜測定。
8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
準(zhǔn)確移取土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用甲醇咪唑緩沖溶液稀釋成土霉素和四環(huán)素濃度分別為50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml，金霉素和多西環(huán)素濃度分別為100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、1 000 ng/ml、2 000 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液供高效液相色譜測定。以待測物峰面積為縱坐標(biāo)、相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
8.4測定
8.4.1液相色譜參考條件
a）色譜柱：c18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），或相當(dāng)者；
b）柱溫：40℃；
c）進(jìn)樣量：30μl；
d）流速：0.8 ml/min；
e）激發(fā)波長：380 nm；
f）發(fā)射波長：520 nm；
g）流動相：甲醇-咪唑緩沖溶液。
8.4.2測定法
取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰面積定量，外標(biāo)法計算。標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖見附錄b中的圖b. 1。
8.5空白試驗
取空白試料，除不加標(biāo)準(zhǔn)溶液外，采用相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。
9結(jié)果計算和表述
試樣中待測物殘留量按標(biāo)準(zhǔn)曲線或公式（1）計算。
式中：
x——試樣中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素含量的數(shù)值，單位為微克每千克（μg/kg）；
a——試樣中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的峰面積；
as——標(biāo)準(zhǔn)溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的峰面積；
cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素濃度的數(shù)值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v——最終試樣定容體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——供試試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
10檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度
10. 1靈敏度
本方法在水產(chǎn)品可食組織中土霉素和四環(huán)素的檢測限均為10.0μg/kg，多西環(huán)素和金霉素的檢測限均為20.0μg/kg；土霉素和四環(huán)素的定量限均為20.0μg/kg，多西環(huán)素和金霉素定量限均為40.0μg/kg。
10.2準(zhǔn)確度
土霉素和四環(huán)素在20.0μg/kg~200μg/kg添加濃度的回收率為60%~110%；多西環(huán)素和金霉素在40.0μg/kg~ 400μg/kg添加濃度的回收率為60%~110%。
10.3精密度
本方法的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%。
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