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PCR反應體系解析

pcr反應體系解析如下:
1、引物
引物與模板配對的長度應至少為17個核苷酸,最高不宜超過30個核苷酸,最佳長度為20-24個核苷酸,如需插入酶切位點,應在酶切位點5'端多加幾個堿基,有利于酶切。引物的(g+c)%含量組成應均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體;兩個引物中(g+c)%含量應盡量相似;引物內部應避免形成明顯的二級結構,如發夾結構;兩個引物之間不應發生互補;特別是在引物3'端最好有富有gc,這樣退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需經過色譜層析或page純化,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。引物的終濃度一般為0.1-1μm左右,濃度太高會導致非特異性擴增,太低則擴增產物太少。
2、模板
模板可以是單鏈dna,也可以是雙鏈dna,質粒dna的擴增效率略低于線狀dna。模板量一般不需太多,不超過1μg為宜,因為模板量過多可能導致非特異性擴增增加,但是要考慮模板中靶序列的含量。例如:使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,就需要適當加大模板用量。
3、緩沖液buffer
緩沖液的ph值,鹽離子濃度、助溶劑成分等都會對pcr反應產生影響。taq酶通用緩沖液ph值為8.4。mg2+濃度為1.5mm,可以適用于大多數pcr反應,但它并非對任何模板和引物的組合都是最佳的。
4、dna聚合酶
50μl反應體系可用0.5-5u酶,酶量的選擇與模板dna的量、擴增片段大小等有關,酶量過多易發生非特異性反應,而且可能增加突變的機率,尤其在進行高保真擴增時,應盡量減少酶量,但酶量過少時反應性能會下降。

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