小鼠肺炎病毒(PVM)ELISA試劑盒詳細(xì)操作流程？
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于檢測(cè)小鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中肺炎病毒(pvm)水平。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（elisa）測(cè)定標(biāo)本中小鼠肺炎病毒(pvm)。用純化的肺炎病毒(pvm)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中肺炎病毒(pvm)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與hrp標(biāo)記的肺炎病毒(pvm)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗滌后加底物tmb顯色。tmb在hrp酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（od值），與cutoff值相比較，從而判定標(biāo)本中小鼠肺炎病毒(pvm)的存在與否。
試劑盒組成：
試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說(shuō)明書(shū)
1份
1份
封板膜
2片（48）
2片（96）
密封袋
1個(gè)
1個(gè)
酶標(biāo)包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
陰性對(duì)照
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
陽(yáng)性對(duì)照
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
酶標(biāo)試劑
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑a液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑b液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
終止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
濃縮洗滌液
（20ml×20倍）×1瓶
（20ml×30倍）×1瓶
2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇edta或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用pbs（ph7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的pbs，ph7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的pbs（ph7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含nan3的樣品，因nan3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（hrp）活性。
操作步驟：
編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
配液：將30（48t的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
溫育：操作同3。
洗滌：操作同5。
顯色：每孔先加入顯色劑a 50μl，再加入顯色劑b 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（od值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
結(jié)果判定：
試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.20
臨界值（cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品od值<臨界值（cut off）者為肺炎病毒(pvm)陰性
陽(yáng)性判定：樣品od值≥臨界值（cut off）者為肺炎病毒(pvm)陽(yáng)性
注意事項(xiàng)
1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請(qǐng)避光保存。
6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2m的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月
關(guān)鍵詞：酶標(biāo)儀
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下面將介紹韌性餅干生產(chǎn)線(xiàn)的關(guān)鍵要素和工藝流程
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（elisa）測(cè)定標(biāo)本中小鼠肺炎病毒(pvm)。用純化的肺炎病毒(pvm)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中肺炎病毒(pvm)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與hrp標(biāo)記的肺炎病毒(pvm)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗滌后加底物tmb顯色。tmb在hrp酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（od值），與cutoff值相比較，從而判定標(biāo)本中小鼠肺炎病毒(pvm)的存在與否。
試劑盒組成：
試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說(shuō)明書(shū)
1份
1份
封板膜
2片（48）
2片（96）
密封袋
1個(gè)
1個(gè)
酶標(biāo)包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
陰性對(duì)照
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
陽(yáng)性對(duì)照
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
酶標(biāo)試劑
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑a液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑b液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
終止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
濃縮洗滌液
（20ml×20倍）×1瓶
（20ml×30倍）×1瓶
2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇edta或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用pbs（ph7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的pbs，ph7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的pbs（ph7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含nan3的樣品，因nan3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（hrp）活性。
操作步驟：
編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
配液：將30（48t的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
溫育：操作同3。
洗滌：操作同5。
顯色：每孔先加入顯色劑a 50μl，再加入顯色劑b 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（od值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
結(jié)果判定：
試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.20
臨界值（cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品od值<臨界值（cut off）者為肺炎病毒(pvm)陰性
陽(yáng)性判定：樣品od值≥臨界值（cut off）者為肺炎病毒(pvm)陽(yáng)性
注意事項(xiàng)
1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請(qǐng)避光保存。
6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2m的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月
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