AAV空衣殼/實衣殼分離純化的影響因素之色譜參數
色譜載體的類型（整體柱、樹脂、膜等）、固相載體介質和使用的流動相，都會影響到分離成功與否。選擇正確的工具和條件組合會帶來想要的結果。然而，還有其他因素，如柱溫、流動相制備的準確性以及最重要的柱平衡，這些因素對于最佳分離至關重要，但很容易被忽視，尤其是最后一個因素。
primas和qa介質采用梯度洗脫（分別為電導率和ph值）方式來分離空衣殼和實衣殼。由于這種分離是基于兩者之間微小的衣殼差異，因此會對色譜參數的微小變化很敏感。尤其是如果整個過程由多人操作時，其中一些參數可能不明顯且分析后難以確定。為了建立認知，本文使用primas介質作為模型評估了其中的幾個因素。此外，本文還說明了為什么使用電導率和 ph檢測器對于理解樣品結果之間的不一致性非常重要。
這些結果也可考慮應用于qa介質及其他介質，然而結果會有一定程度的變化。
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實驗方法
使用0.2 ml primastm整體柱進行方法開發，用aav 2/8血清型樣本進行檢測。為了評估色譜參數，從色譜圖中獲取空衣殼和實衣殼的保留時間和洗脫ph值向樣品中加入色氨酸，將其作為一種非結合示蹤劑（流穿峰）。
patfix® hplc系統用于色譜實驗
檢測器：
ph和電導率
熒光（ex/em：280/348 nm）
緩沖液組成（ph梯度）：
緩沖液a：10 mm btp、10 mm（tris）、2 mm氯化鎂（mgcl2）、1%山梨醇、0.1% poloxamer188，ph 8.00
緩沖液b：10 mm btp、10 mm（tris）、10 mm氯化鈉（nacl）、2 mm 氯化鎂（mgcl2）、1%山梨醇、0.1% poloxamer188，ph 9.50
梯度：從100%緩沖液a到100%緩沖液b，5.0分鐘梯度。
cip和柱平衡：10 cv 0.1 m（naoh）和1 m氯化鈉（nacl）；30 cv 0.1 m乙酸和1 m氯化鈉，ph 5；20 cv雙蒸水（ddh2o）；20 cv緩沖液a；20 cv緩沖液b；40 cv緩沖液a
結果
溫度變化對空衣殼（e）/ 實衣殼（f）分離的影響:
圖1: 在23℃、26℃和30℃三種不同溫度下進行的aav空衣殼/實衣殼分離的色譜圖
溫度升高會顯著提高空衣殼和實衣殼之間的分辨率，但也會影響保留時間（圖 1）。雖然潛在的機制很多，但較高的溫度確實會增加分子動能，進而影響分子-分子和分子-整體柱相互作用。
為了成功應用，需了解aav結合特性（電導率、ph、t）并保持溫度穩定。使用柱溫箱對于提供可重現的色譜柱性能至關重要。然而我們在使用制備柱時確實需要注意這一點，它對于可重現性分析至關重要。
如果要將緩沖液置于恒溫箱中，則可對其進行預熱，或可以在進入色譜柱之前使用金屬線圈進行預熱。有些緩沖液比其他緩沖液更值得注意，因為它們的ph值容易受溫度影響（如tris）。其他應用場景也是如此，如pdna同種型分離非常依賴溫度。
還必須控制柱溫。最重要的是，冷藏過的色譜柱，應該將它預熱到工作條件。
使用primas柱時效果可觀，但在使用cimac aav full/empty（qa基質）柱時也觀察到效果顯著。
緩沖液制備影響空衣殼/實衣殼分離:
圖2: 使用ph 8.00±0.05的緩沖液a進行aav空衣殼/實衣殼分離的色譜圖
緩沖液制備對分離性能有影響（圖 2）。ph 和電導率都是色譜方法優化的關鍵因素，因此應該嚴格控制?，F有例子顯示了 ph 值變化對分辨率和保留時間的影響。在某些情況下，影響可能比圖 2 中觀察到的更大。
雖然如圖所示分析了 ph 值的影響，但電導率也非常重要。滴定過程中 ph 值被過度校正（ph 值降到目標值以下必須重新調高）時要注意。這會增加離子濃度，因此盡管達到了正確的 ph 值，但仍增加了電導率。在這種情況下，丟棄緩沖液并重新開始配制新緩沖液可減少阻礙。這適用于使用 primas、qa 和其他基質整體柱時。
要了解并控制 ph 值及電導率對色譜分離的影響，使用 ph 計尤其是電導率檢測器至關重要。缺乏此類知識會使我們變得盲目，并在分析不可重現性或其他異?，F象背后原因時很難提供指導。
對于 primas，ph 值的精度必須達到 1%，才能獲得可重現的結果。這可通過使用精確質量標準化 的1 m hcl 調節 ph 值來實現。
柱平衡對空衣殼/實衣殼分離的影響
圖3: 不同柱平衡條件下進行aav空衣殼/實衣殼分離的色譜圖
在使用制備型色譜或分析型色譜時，為了獲得可重現的結果和更大化峰分辨率而采取的較簡單預防措施，也是往往被忽視的一種：色譜柱平衡。很容易觀察到并再次顯示在圖3 中，如果色譜柱未完全平衡，峰之間的分辨率會顯著降低。無論是離子交換(qa)色譜柱還是混合模式色譜柱，如 primas（離子交換與氫鍵結合），為了適當的樣品結合來準備色譜柱是不可少的。
在進行分析時，電導率和ph檢測器將幫助我們確認色譜柱是否已平衡。最好標志是與空白樣品相比，電導率和 ph 信號接近基線。柱平衡后的推薦步驟是在注入樣品之前上至少 3 個空白樣品（或直到所有信號軌跡在運行之間可重現）。
對于制備型色譜，這主要取決于柱出口處的 ph 和電導率信號是否與柱前測量值相匹配。
開始開發使用色譜柱時嚴格按照說明書進行。在此過程的后期，可以根據經驗優化柱平衡條件（減少特定緩沖液的 cv，或例如在平衡期間過渡到靜態保持步驟——沒有流速以節省緩沖液）。
值得注意的是需要在原位清洗（cip）后中和色譜柱，尤其是在使用不同濃度的 naoh 時。使用 1 m 乙酸鈉或選擇等同強度緩沖液（如在方法本身中使用的緩沖液）。繼續用去離子水洗滌。之后，將平衡緩沖液用于新的色譜運行或用于作為長期儲存的儲存溶液。此步驟對于獲得最佳柱效至關重要。如需精確的分步指導，請搜索隨附的說明手冊。
系統空隙體積的影響
圖4: 空衣殼/實衣殼aav分離色譜圖：基于檢測器dt(ph-fld)的延遲
空隙體積在解釋和評價色譜參數時起著重要作用，特別是在高空隙體積系統上運行小色譜柱時，空隙體積的影響會更加顯著。圖 4顯示了ph及熒光檢測器的延遲——分析物首先通過ph檢測器，再通過熒光檢測器。如果采用檢測器dt(ph-fld)校正，則可獲得更準確的結果。
必須考慮方法進程指示信號（例如電導率和 ph 值）與 uv、熒光或 mals 信號之間的色譜系統配置延遲。
結論
為了在cimac primas™和cimac aav full/empty色譜柱上進行可重現性的aav空衣殼/實衣殼分離，重要的是：
· 控制色譜柱、流動相和樣品溫度。對于色譜柱和流動相，請使用恒溫箱?；蛟谏V柱前使用金屬線圈在流動相流到色譜柱時對其進行加熱（這只會加熱緩沖液，對色譜柱本身作用不大）。進樣前恒溫樣品。
· 準備緩沖液時要注意精度。設置可接受的誤差以減少不受控制的波動。
· 平衡色譜柱。好的起點是遵循應用手冊并根據經驗進行優化。
· 考慮色譜配置條件并考慮在信號上觀察到的任何延遲。
一直以來，bia separations是質粒dna、aav、mrna高效率純化。不僅提供整體柱及平臺方法，還提供定制的純化服務，以滿足質粒dna、aav、mrna規?；a的純化需求。
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這些結果也可考慮應用于qa介質及其他介質，然而結果會有一定程度的變化。
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實驗方法
使用0.2 ml primastm整體柱進行方法開發，用aav 2/8血清型樣本進行檢測。為了評估色譜參數，從色譜圖中獲取空衣殼和實衣殼的保留時間和洗脫ph值向樣品中加入色氨酸，將其作為一種非結合示蹤劑（流穿峰）。
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緩沖液a：10 mm btp、10 mm（tris）、2 mm氯化鎂（mgcl2）、1%山梨醇、0.1% poloxamer188，ph 8.00
緩沖液b：10 mm btp、10 mm（tris）、10 mm氯化鈉（nacl）、2 mm 氯化鎂（mgcl2）、1%山梨醇、0.1% poloxamer188，ph 9.50
梯度：從100%緩沖液a到100%緩沖液b，5.0分鐘梯度。
cip和柱平衡：10 cv 0.1 m（naoh）和1 m氯化鈉（nacl）；30 cv 0.1 m乙酸和1 m氯化鈉，ph 5；20 cv雙蒸水（ddh2o）；20 cv緩沖液a；20 cv緩沖液b；40 cv緩沖液a
結果
溫度變化對空衣殼（e）/ 實衣殼（f）分離的影響:
圖1: 在23℃、26℃和30℃三種不同溫度下進行的aav空衣殼/實衣殼分離的色譜圖
溫度升高會顯著提高空衣殼和實衣殼之間的分辨率，但也會影響保留時間（圖 1）。雖然潛在的機制很多，但較高的溫度確實會增加分子動能，進而影響分子-分子和分子-整體柱相互作用。
為了成功應用，需了解aav結合特性（電導率、ph、t）并保持溫度穩定。使用柱溫箱對于提供可重現的色譜柱性能至關重要。然而我們在使用制備柱時確實需要注意這一點，它對于可重現性分析至關重要。
如果要將緩沖液置于恒溫箱中，則可對其進行預熱，或可以在進入色譜柱之前使用金屬線圈進行預熱。有些緩沖液比其他緩沖液更值得注意，因為它們的ph值容易受溫度影響（如tris）。其他應用場景也是如此，如pdna同種型分離非常依賴溫度。
還必須控制柱溫。最重要的是，冷藏過的色譜柱，應該將它預熱到工作條件。
使用primas柱時效果可觀，但在使用cimac aav full/empty（qa基質）柱時也觀察到效果顯著。
緩沖液制備影響空衣殼/實衣殼分離:
圖2: 使用ph 8.00±0.05的緩沖液a進行aav空衣殼/實衣殼分離的色譜圖
緩沖液制備對分離性能有影響（圖 2）。ph 和電導率都是色譜方法優化的關鍵因素，因此應該嚴格控制?，F有例子顯示了 ph 值變化對分辨率和保留時間的影響。在某些情況下，影響可能比圖 2 中觀察到的更大。
雖然如圖所示分析了 ph 值的影響，但電導率也非常重要。滴定過程中 ph 值被過度校正（ph 值降到目標值以下必須重新調高）時要注意。這會增加離子濃度，因此盡管達到了正確的 ph 值，但仍增加了電導率。在這種情況下，丟棄緩沖液并重新開始配制新緩沖液可減少阻礙。這適用于使用 primas、qa 和其他基質整體柱時。
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在使用制備型色譜或分析型色譜時，為了獲得可重現的結果和更大化峰分辨率而采取的較簡單預防措施，也是往往被忽視的一種：色譜柱平衡。很容易觀察到并再次顯示在圖3 中，如果色譜柱未完全平衡，峰之間的分辨率會顯著降低。無論是離子交換(qa)色譜柱還是混合模式色譜柱，如 primas（離子交換與氫鍵結合），為了適當的樣品結合來準備色譜柱是不可少的。
在進行分析時，電導率和ph檢測器將幫助我們確認色譜柱是否已平衡。最好標志是與空白樣品相比，電導率和 ph 信號接近基線。柱平衡后的推薦步驟是在注入樣品之前上至少 3 個空白樣品（或直到所有信號軌跡在運行之間可重現）。
對于制備型色譜，這主要取決于柱出口處的 ph 和電導率信號是否與柱前測量值相匹配。
開始開發使用色譜柱時嚴格按照說明書進行。在此過程的后期，可以根據經驗優化柱平衡條件（減少特定緩沖液的 cv，或例如在平衡期間過渡到靜態保持步驟——沒有流速以節省緩沖液）。
值得注意的是需要在原位清洗（cip）后中和色譜柱，尤其是在使用不同濃度的 naoh 時。使用 1 m 乙酸鈉或選擇等同強度緩沖液（如在方法本身中使用的緩沖液）。繼續用去離子水洗滌。之后，將平衡緩沖液用于新的色譜運行或用于作為長期儲存的儲存溶液。此步驟對于獲得最佳柱效至關重要。如需精確的分步指導，請搜索隨附的說明手冊。
系統空隙體積的影響
圖4: 空衣殼/實衣殼aav分離色譜圖：基于檢測器dt(ph-fld)的延遲
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必須考慮方法進程指示信號（例如電導率和 ph 值）與 uv、熒光或 mals 信號之間的色譜系統配置延遲。
結論
為了在cimac primas™和cimac aav full/empty色譜柱上進行可重現性的aav空衣殼/實衣殼分離，重要的是：
· 控制色譜柱、流動相和樣品溫度。對于色譜柱和流動相，請使用恒溫箱?；蛟谏V柱前使用金屬線圈在流動相流到色譜柱時對其進行加熱（這只會加熱緩沖液，對色譜柱本身作用不大）。進樣前恒溫樣品。
· 準備緩沖液時要注意精度。設置可接受的誤差以減少不受控制的波動。
· 平衡色譜柱。好的起點是遵循應用手冊并根據經驗進行優化。
· 考慮色譜配置條件并考慮在信號上觀察到的任何延遲。
一直以來，bia separations是質粒dna、aav、mrna高效率純化。不僅提供整體柱及平臺方法，還提供定制的純化服務，以滿足質粒dna、aav、mrna規?；a的純化需求。
制冷加熱一體溫度控制機：未來科技的杰出代表
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純化水設備純化水電導率不穩定原因分析
硅酸鹽成分分析中低含量元素測定問題剖析
煤泥烘干機漸漸浮出了水面
AAV空衣殼/實衣殼分離純化的影響因素之色譜參數
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巡檢儀功能特點
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