盡管嵌合抗原受體（car-t）細胞改變了治療b細胞惡性腫瘤的前景，但由于大多數腫瘤靶抗原是與正常細胞共享，導致了car-t對實體瘤治療的毒副作用，所以在一定程度上阻礙了其在實體瘤治療中的發展。因此，很多研究人員試圖應用布爾邏輯門控（boolean logic gate, 就是and,or,not）方法對car-t細胞進行預防毒性。
t細胞有兩種car，針對兩種腫瘤特異性抗原（taa），兩種car帶有不同的傳導信號激發因子。只有兩種car同時結合兩種taa，才能共激發對腫瘤殺傷效應的信號轉導稱為and；一旦結合一種正常細胞表達的抗原就不激發稱為not；結合一種taa就激發稱為or。
最近的一篇來自于斯坦福大學的nature文章中[2]，作者使用zap-70（一種細胞內近端t細胞信號分子）取代傳統的cd3ζ 結構域分子，可以激活t細胞并在體內根除腫瘤，同時可以繞過上游信號傳導。zap-70的主要作用是磷酸化lat和slp-76，于是將lat和slp-76設計成基于and的邏輯門控細胞內網絡（link car）。但是從這篇文章來看，這種and設計并不是一帆風順的。
這篇文章評估car-t細胞殺傷作用的主要方法用到了大家耳熟能詳的incucyte® 實時活細胞分析系統，incucyte® 也成為這篇nature的核心技術。
在設計and邏輯門的car時，一個關鍵問題是如何避免出現自發二聚體，降低腫瘤殺傷的特異性作用。
首先，是對不同跨膜域的選擇，考慮到如果用同樣的跨膜結構域可能會產生二聚體，所以應盡量使用不同的跨膜結構域。基于此，作者首先研究了aa，bb，ab，ba四種跨膜域組合（a為cd28tm，b為cd8tm）。
圖3：incucyte® 實驗顯示,只有cd19-28tm-lat+her2-8tm-slp-76（ab組合）顯示出了一定的and作用，但是仍然殺傷了cd19單陽。
為了進一步降低同源二聚或者異源二聚的可能性，突變了cd28tm上的一個半胱氨酸位點（2ca），但是仍然無法提高特異性。
lat和slp-76不會結合，為什么還是不行呢？作者進一步研究了這個信號通路發現，下游的一個適配分子 gads，可能會同時和兩個car結合，所以依然會形成二聚體。所以將兩個car上的gads結合位點的敲除后，特異性就提高了，真正獲得了and效果！
當然作者也嘗試了其他抗原組合，比如cd19和ror1，這種link car依然有效！
當然這種and效果方法不只一個，比如synnotch，但是相對于synnotch，這篇文章的link顯示出更佳的特異性。
這種car可以擴大car-t細胞靶向的分子范圍，并將使car-t能夠用于實體瘤和自身免疫等疾病和纖維化。此外，這項工作表明，細胞的內部信號機制可以重新利用為表面受體，其可能為細胞工程開辟新的途徑。
為什么越來越多的高分文章都使用了incucyte® ？
-參考文獻-
[1] engineering car-t cells for next-generation cancer therapy.cancer cell,2020
[2] co-opting signalling molecules enables logic-gated control of car tcells.nature,2023

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