快速t4 dna連接酶由攜帶t4噬菌體基因30的大腸桿菌產生。這種酶催化雙鏈dna或rna的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。它可以修復雙鏈dna、rna或dna/rna雜交體中的單鏈缺口，并可以用粘性或鈍端連接dna片段。然而，它對單鏈核酸沒有活性。主要用于酶切dna片段的克隆、定點誘變、pcr產物的克隆和雙鏈dna缺口的修復。快速t4 dna連接酶需要atp作為輔助因子，在室溫下僅需10分鐘即可完成粘性末端連接反應
艾美捷快速t4 dna連接酶：
cat #: c-bsm205
size: 1000 u
storage: -20°c
酶活性定義：
在37°c下，1個weiss單位的酶在20分鐘內催化1 nmol[32ppi]轉化為吸附的活性碳。1 weiss單元相當于大約200個內聚末端連接單元（ceu），這類似于在16°c下30分鐘內連接50%hindiii消化的λdna片段。
質量控制
殘余核酸內切酶活性檢測：
在37℃下，將200u的fast t4 dna連接酶與1μg的puc19 dna孵育4小時。未檢測到從共價環狀dna到刻痕dna的轉化。
殘留核酸外切酶活性檢測：
將酶溶液與雙鏈dna底物在37℃下孵育16小時。在
用dna凝膠電泳法檢測雙鏈dna底物。
藍色/白色屏幕：
在室溫下，將puc57 dna/hindii、puc57 dna/pstl或puc57脫氧核糖核酸/smal消化產物與30u快速t4脫氧核糖核酸連接酶孵育1小時。然后將連接產物轉化為有能力的大腸桿菌xl1blue細胞。lessthan1%的白色菌落被檢測到。
快速t4 dna連接酶使用說明：
1.dna插入片段與載體dna的連接（粘性末端連接）：
① 在冰上制備以下反應混合物：
② 充分混合并短暫離心，然后在22°c下孵育10分鐘。
③ 取1-5μl連接產物轉化50μl化學活性細胞，或取1-2μl轉化50μl電活性細胞。
注：如果連接產物用于電穿孔，則使用柱純化或氯仿提取來清潔dna，而不是熱滅活步驟。
2.dna插入片段與載體dna的連接（鈍端連接）
3.線性dna自環化
4.適配器結扎
雙鏈寡核苷酸適配器通常用于在插入片段上產生粘性末端。它們通常含有限制性內切酶識別位點，在連接和酶消化后，這些位點與克隆載體產生相容的末端。有時適配器已經包含與克隆載體兼容的粘性末端，從而消除了在適配器連接后對插入片段進行進一步處理的需要
備注：
快速t4 dna連接酶被高于200mm的nacl或kcl濃度強烈抑制。
連接反應混合物的量不應超過感受態細胞體積的10%，系統中不建議使用過量的fast t4 dna連接酶。
與快速t4 dna連接酶結合的dna可能在瓊脂糖凝膠上表現出帶轉移或涂抹。為了避免這種情況
在這種現象下，可以在裝載前對酶進行熱滅活，如有必要，可以加入適量的sds。
聚乙二醇（peg）顯著提高了鈍端結扎的效率。peg 8000的推薦濃度為連接混合物的5%（w/v）。
電穿孔效率可以通過快速t4 dna連接酶的熱失活或通過使用柱純化或氯仿提取進行dna純化來提高。轉化體的數量可以通過將反應時間延長到1小時來增加。
該試劑僅用于科學研究領域，不適用于臨床診斷或其他用途。

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