PCR結果不滿意參考建議
pcr是聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的dna片段，可看作生物體外的特殊dna復制。通過dna基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別。pcr驗室又叫基因擴增實驗室。pcr結果總是不滿意，可參考以下建議：
1、將pcr反應的試管與反應板緊貼。
2、當酶反應混合物以70℃“熱啟動”開始循環時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的pcr管中不能均勻傳熱。
3、不要隨意減少dntp的用量，它是一個系統的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對于有問題的pcr反應，例如模板的量少，模板不純和環狀模板等，先嘗試加taq酶前的體系進行預變性，后加模板進行正常pcr擴增。
5、沒有擴增產物：在提供mgcl2緩沖液中，以0.25mmol/l為梯度增加mgcl2濃度；無mgcl2的緩沖液以0.5 mmol/l為梯度增加mgcl2濃度。
6、泳道中出現模糊條帶，如果dna模板中存在rna，則按上述提示濃度補加mgcl2，因為在pcr反應中可能缺少游離的mg2+。
7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
8、檢查模板和引物的用量。
9、增加循環次數和/或模板dna的用量。
10、泳道中出現模糊條帶： 減少循環次數或模板dna的用量。提高退火溫度，但不要超過68℃。 重新設計引物或設計更長的引物。
11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。最佳反應體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的pcr儀可以不加）。大多數反應中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數情況下可以得到滿意的結果。建議使用1.75mmol/l mgcl2∶350mmol/l dntp或2.25mmol/l mgcl2∶500mmol/l dntp組合的混合物。然而要得到最佳結果，優化mg2+的濃度是必需的。
12、基因組dna模板的質量顯著影響pcr反應。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測dna的長度。dna片段長度可以超過50kb，傳統的基因組dna能擴增片段至10kb。要擴增更長的片段應使用超純或高分子量的dna。請查閱高分子量dna提取操作過程相關文獻。降低二級結構和引物二聚物形成的可能性。進行長片段pcr擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高pcr反應的退火溫度來增加反應的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優先擴增的影響。
13、變性：第一步變性在94℃下進行2分鐘。在循環過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進行20--30秒），除非模板中富含gc，則95℃下變性30秒。這可以防止dna脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組dna片段終長度超過12 kb時，應該盡可能的降低變性溫度。
14、延伸：68--72℃下進行延伸操作。循環延伸：盡量采用循環延伸的條件，若pcr儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷pcr系統擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的a，因此建議采用t/a克隆。若要進行平端可隆，可用klenow酶和t4 dna多聚酶將pcr產物補平后再進行。測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用sanger方法進行測序不能產生均一的（染色體）帶型。
15、引物設計： 一般長度20-30bp； 至少50%的gc含量；避免引物二聚體和二級結構； 引物對的tm值應該接近。
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3、不要隨意減少dntp的用量，它是一個系統的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對于有問題的pcr反應，例如模板的量少，模板不純和環狀模板等，先嘗試加taq酶前的體系進行預變性，后加模板進行正常pcr擴增。
5、沒有擴增產物：在提供mgcl2緩沖液中，以0.25mmol/l為梯度增加mgcl2濃度；無mgcl2的緩沖液以0.5 mmol/l為梯度增加mgcl2濃度。
6、泳道中出現模糊條帶，如果dna模板中存在rna，則按上述提示濃度補加mgcl2，因為在pcr反應中可能缺少游離的mg2+。
7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
8、檢查模板和引物的用量。
9、增加循環次數和/或模板dna的用量。
10、泳道中出現模糊條帶： 減少循環次數或模板dna的用量。提高退火溫度，但不要超過68℃。 重新設計引物或設計更長的引物。
11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。最佳反應體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的pcr儀可以不加）。大多數反應中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數情況下可以得到滿意的結果。建議使用1.75mmol/l mgcl2∶350mmol/l dntp或2.25mmol/l mgcl2∶500mmol/l dntp組合的混合物。然而要得到最佳結果，優化mg2+的濃度是必需的。
12、基因組dna模板的質量顯著影響pcr反應。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測dna的長度。dna片段長度可以超過50kb，傳統的基因組dna能擴增片段至10kb。要擴增更長的片段應使用超純或高分子量的dna。請查閱高分子量dna提取操作過程相關文獻。降低二級結構和引物二聚物形成的可能性。進行長片段pcr擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高pcr反應的退火溫度來增加反應的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優先擴增的影響。
13、變性：第一步變性在94℃下進行2分鐘。在循環過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進行20--30秒），除非模板中富含gc，則95℃下變性30秒。這可以防止dna脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組dna片段終長度超過12 kb時，應該盡可能的降低變性溫度。
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15、引物設計： 一般長度20-30bp； 至少50%的gc含量；避免引物二聚體和二級結構； 引物對的tm值應該接近。
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