巖藻多糖的制備方法與生物活性研究！
巖藻多糖的制備方法與生物活性研究！
一、背景及概述
巖藻多糖(fucoidin) 是一類含有l-巖藻糖和硫酸基團的水溶性多糖，也稱褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖膠，主要來源于褐藻、紅藻和一些海洋無脊椎動物。低分子量巖藻多糖具有抗凝血、抗病毒、抗血栓、抗腫瘤、增強免疫力等活性，被廣泛地應用于醫藥領域和現代食品工業。
二、制備方法
方法一、
一種酶法提取海藻中巖藻多糖的工藝，其步驟包括：
（1）海藻預處理：將干燥的海藻剪切成適宜大小，然后用粉碎機粉碎成粉末狀，向該海藻粉末中加入7～15倍（重量比）的水，于30～80℃水浴中浸泡2～8 h，使其充分吸水溶脹。
（2）巖藻多糖的提取：向上述充分吸水溶脹的海藻浸泡液中加入為海藻重量的0.03～1.2%復合纖維素酶，控制ph 3.5～6.0，30～50℃下反應4～15 h；然后加入為海藻重量的0.01～0.8%復合蛋白酶，控制ph 6.5～10，上述溫度下反應2～8 h。反應結束后，離心分離酶解液，殘渣加入少量水充分攪拌、離心，合并兩次酶解液，此酶解液中除含有巖藻多糖外，還包含一定量的海藻酸、蛋白質以及其它雜質。
（3）巖藻多糖的分離純化：上述得到的酶解液先用硫酸調節ph 2～4.5，將其中的海藻酸類物質沉淀出來，然后加入石灰水，調節溶液的ph為6～9，過濾，進一步除去海藻酸雜質；澄清濾液在70～85℃經雙效濃縮為原體積的1/2～1/4，然后加入1～3倍體積的乙醇，使其中的巖藻多糖沉淀出來，最后經多次脫水、烘干得到高純度巖藻多糖產品。
方法二、
一種均一性小分子巖藻多糖的制備方法，所述方法為：(1)粗巖藻多糖提取：將干海帶粉與溶劑混合，在60-100℃浸提1-5h，將浸提液離心(優選5000-10000r/min)，獲得提取液；并將提取液減壓濃縮至1/2-1/15體積(優選50℃-70℃減壓濃縮至1/10)，獲得濃縮液；所述溶劑為體積濃度95％乙醇水溶液或去離子水；所述溶劑體積用量以干海帶粉質量計為25-50ml/g(優選30ml/g)；然后向濃縮液中加質量濃度1％～4％cacl2水溶液，攪拌至無沉淀產生(優選攪拌4h)，離心，取上清液濃縮至1/2～1/3倍體積后，采用sevage法除蛋白直至水層與sevage溶液層中間未出現白色層，取水層旋轉蒸發除去殘留的氯仿，用14kda透析袋于去離子水中透析；取截留液加入無水乙醇至乙醇體積濃度為50％-90％，攪拌，在4℃下靜置過夜，離心，沉淀干燥，得粗巖藻多糖；(2)粗巖藻多糖純化：將粗巖藻多糖用去離子水溶解后，上樣deae-52纖維素陰離子交換柱，分別用去離子水，0.3m nacl水溶液、0.6m nacl水溶液、0.9m nacl水溶液、1.5m nacl水溶液、2.0m nacl水溶液進行洗脫，分別收集0.9m nacl水溶液、1.5m nacl水溶液、2.0m nacl水溶液對應的三種流出液，分別用14kda透析袋于去離子水中透析，取截留液凍干(12-24h)，分別獲得三種純化巖藻多糖；(3)小分子巖藻多糖的制備：將步驟(2)獲得的三種純化巖藻多糖用濃度為0.01～0.2mol/l的hcl水溶液制成質量濃度為0.5～5％的巖藻多糖溶液，于30℃-100℃下攪拌水解10min-2h，反應液調ph為7(優選用1mol/l的naoh)后，用3.5kda透析袋于去離子水中透析24h，取截留液濃縮至1/3體積后，加入體積濃度10～30％h2o2水溶液溶解，再加入體積濃度5～20％氨水調節ph為8.5，室溫(25-30℃)避光放置30min，離心，上清液用3.5kda透析袋于去離子水中透析，凍干，分別獲得三種小分子巖藻多糖，所述小分子巖藻多糖分子量均小于10kda，優選5-9kda。
三、生物活性
吳俊仙等人探討了巖藻多糖抑制炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,ibd)的作用及其機制。方法:將小鼠隨機分為實驗組和對照組(每組5只),實驗組給予巖藻多糖灌胃2周,對照組給予飲用水灌胃2周,隨后兩組小鼠均自由飲用溶有葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt,dss)的水溶液,構建ibd小鼠模型。檢測小鼠體重、脾臟重量、結腸長度及重量,he染色觀察結腸組織病理變化,觀察大便性狀并評分;運用實時熒光定量pcr(real-time fluorescence quantitative pcr,qpcr)檢測炎癥因子、趨化因子和緊密連接蛋白的mrna水平變化。結果:巖藻多糖處理的實驗組小鼠腸炎相關指標顯著優于對照組,炎癥程度減弱。結論:巖藻多糖能夠預防和抑制ibd的發生,為預防和治療ibd提供新方法和依據。
目前，科學家們在體外和體內的研究已經證明了巖藻多糖的抗腫瘤的作用，包括在各種癌癥細胞中抑制生長、轉移、血管生成和誘導細胞凋亡。此外，巖藻多糖還能夠與巨噬細胞作用產生細胞因子和趨化因子增強機體的免疫功能，從而間接抑制腫瘤細胞的生長。巖藻多糖還具有免疫調節作用，因此在與化療藥物及放療進行聯合使用時，可緩解化療帶來的副作用。
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方法一、
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（1）海藻預處理：將干燥的海藻剪切成適宜大小，然后用粉碎機粉碎成粉末狀，向該海藻粉末中加入7～15倍（重量比）的水，于30～80℃水浴中浸泡2～8 h，使其充分吸水溶脹。
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（3）巖藻多糖的分離純化：上述得到的酶解液先用硫酸調節ph 2～4.5，將其中的海藻酸類物質沉淀出來，然后加入石灰水，調節溶液的ph為6～9，過濾，進一步除去海藻酸雜質；澄清濾液在70～85℃經雙效濃縮為原體積的1/2～1/4，然后加入1～3倍體積的乙醇，使其中的巖藻多糖沉淀出來，最后經多次脫水、烘干得到高純度巖藻多糖產品。
方法二、
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