RNA實驗和方案新手必讀（三）
rna分離：起始材料的破碎和勻漿
起始材料的有效破碎和勻漿對于所有總rna分離操作來說都是必須的要求。破碎和勻漿是兩個獨立分開的步驟。
破碎：對于組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的*破碎對于釋放樣本中所有的rna是必要的。不同樣本需要使用不同的方法以達(dá)到*的破碎效果。不*的破碎會導(dǎo)致rna得率的顯著降低。勻漿：勻漿對于減少破碎后細(xì)胞裂解產(chǎn)物的粘性是十分必要的。勻漿能夠切斷分子量的基因組dna及其他分子量的細(xì)胞組分，得到均勻的裂解產(chǎn)物。勻漿不夠*會導(dǎo)致rna結(jié)合效率的下降而顯著降低得率。某些破碎方法能夠同時對樣本起到勻漿作用，而其他方法還是需要專門的勻漿步驟。表針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準(zhǔn)則**概述了適用于多種起始材料的不同破碎和勻漿方法。當(dāng)您針對所使用的起始材料選擇合適的操作方法時，該表格可用來作為參考。下面也將針對破碎和勻漿方法進(jìn)行更為詳細(xì)的論述。
使用玻珠研磨機進(jìn)行破碎和勻漿
在使用玻珠研磨機破碎樣本的過程中，樣本與珠子被起進(jìn)行速攪拌。通過珠子與細(xì)胞碰撞時的流體動力切割和破碎作用，同步完成破碎和勻漿過程。破碎效率的影響因素有：
珠子的大小和組成緩沖液與珠子的比例起始樣本的數(shù)量攪拌速度和設(shè)定處理時間**破碎時所使用的理想珠型為0.1毫米（平均直徑）的玻璃珠，用于酵母和單細(xì)胞動物細(xì)胞時為0.5毫米的玻璃珠，對動植物組織則應(yīng)使用3–7毫米的不銹鋼珠。請確保玻璃珠經(jīng)過濃硝酸的預(yù)先潤洗。或者可直接購買和使用市售的經(jīng)酸洗滌過的玻璃珠。關(guān)于破碎的其他參數(shù)需要依據(jù)每應(yīng)用的經(jīng)驗進(jìn)行設(shè)定。植物材料以及相關(guān)的珠子和破碎管可先在液氮中預(yù)冷，破碎應(yīng)在無裂解緩沖液的條件下進(jìn)行。對于動物組織則應(yīng)使用干燥的冷凍粉碎。冷凍粉碎（無論是在玻珠研磨機中還是使用研缽和杵）不同于緩沖液裂解，不會對樣本同時起到勻漿作用。
使用轉(zhuǎn)子——定子勻漿器進(jìn)行破碎和勻漿
在裂解緩沖液的存在下，轉(zhuǎn)子–定子勻漿機可同時完成對動物組織的*破碎和勻漿，所需時間基于樣本的堅韌程度，可在5–90秒內(nèi)完成。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機也可以用于細(xì)胞裂解產(chǎn)物的勻漿。轉(zhuǎn)子的超速旋轉(zhuǎn)能夠以擾動和機械剪切的綜合方式，完成對樣本的破碎和勻漿。使用適當(dāng)大小的管子，在勻漿過程中始終保證勻漿器頭部直處于浸沒狀態(tài)，并持續(xù)將勻漿器頭部伸入管子末端，以確保勻漿過程中樣本內(nèi)的泡沫達(dá)到少。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機有不同大小型號可供選擇，并可裝配不同大小的探頭。5 mm和7 mm的探頭適合在300 µl以下的體積內(nèi)使用，并可用于離心管內(nèi)的勻漿。10 mm及以上尺寸的探頭則適用于更大的管子。
使用研缽和杵破碎
使用研缽和杵破碎時，先將樣本進(jìn)行迅速的液氮冷凍，并在液氮中將其研磨為細(xì)粉。將上清液（組織粉末和液氮）轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的適當(dāng)大小的管中，使液氮揮發(fā)但不要讓樣品融解。加入裂解緩沖液，并盡可能快地進(jìn)行后續(xù)步驟。
注：使用研缽和杵研磨樣品會破碎樣品，但無法達(dá)到勻漿的目的。勻漿作用需與此步驟分開進(jìn)行。
使用注射器和針頭完成勻漿
細(xì)胞和組織的裂解產(chǎn)物可以使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿。可以使用20號（0.9 mm）針頭連接個**塑料注射器，通過至少5–10次的吹打切斷分子量的dna，直至裂解產(chǎn)物的勻漿形成。為操作便利和減少樣品損失，也可能需要增加裂解緩沖液的體積。
針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準(zhǔn)則
起始材料
破碎方法
勻漿方法
評論
培養(yǎng)的動物細(xì)胞
加入裂解緩沖液
使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機或注射器和針頭獲取胞質(zhì)rna
如果處理少于1x105個細(xì)胞，可以使用渦動勻漿裂解產(chǎn)物。不勻漿方案。
動物組織
轉(zhuǎn)子–定子勻漿機
轉(zhuǎn)子–定子勻漿機
同步進(jìn)行破碎和勻漿
動物組織
研缽和杵
注射器和針頭
使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機和玻珠研磨機通常比使用研缽和杵的得率更。
動物組織
玻珠研磨機
玻珠研磨機
**
加入裂解緩沖液進(jìn)行酶（*）解
渦旋機
如果處理大于5x108個細(xì)胞，使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿可能會增加得率。
**
玻珠研磨機
玻珠研磨機
玻珠研磨機可同時完成破碎和勻漿；不能使用渦動操作代替玻珠研磨機。
酵母
酶解（*/消解酶）細(xì)胞壁后加入裂解緩沖液，以消化原生質(zhì)球。
渦旋機
酵母
玻珠研磨機
玻珠研磨機
玻珠研磨機可同時完成破碎和勻漿；不能使用渦動操作代替玻珠研磨機。
植物和絲狀**
研缽和杵
注射器和針頭
研缽和杵不能代替轉(zhuǎn)子–定子勻漿機。
從不同樣本來源分離rna的特別注意事項
些樣本來源在其rna或內(nèi)含物方面存在著顯著不同，可能導(dǎo)致rna的分離和分析過程出現(xiàn)問題。當(dāng)操作這些樣本來源時需要些特別注意事項。本節(jié)將針對大量不同樣本來源的操作進(jìn)行探討。
植物
從植物材料中分離rna會遇到些特殊困難，常規(guī)技術(shù)在用于植物樣本之前般要先經(jīng)過條件化。些植物代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)與核酸相似，導(dǎo)致其難于從rna制備產(chǎn)物中除去。（使用不當(dāng)?shù)模┘兓椒ǎㄈ琨}類或*）所導(dǎo)致的代謝物（例如多糖類、多酚類和黃酮類）或污染物與目的rna的共分離，可能造成對酶促反應(yīng)的抑制，或?qū)е伦贤夥止夤舛葴y定和凝膠電泳結(jié)果上的偏差。從植物材料中分離rna的過程中可能遇到的困難還包括由于較粘性導(dǎo)致的吸取體積錯誤，以及儲存過程中的rna降解問題。
通常對植物的生長條件進(jìn)行化，使其不產(chǎn)生水平的植物代謝產(chǎn)物，可有助于對rna的有效分離。由于植物種類之間存在較大差異，因此對其生長條件很難有同的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。不過作為普適原則，建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的rna得率通常于年老組織，因為前者在等重條件下通常比后者包含更多的細(xì)胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外，許多“自定義”的rna分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養(yǎng)1–2天后再進(jìn)行收獲，以避免形成植物代謝物的水平積累。
心臟、肌肉和皮膚組織
從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織類的樣本中分離rna可能比較困難，因為此類樣品中含有大量的收縮性蛋白、結(jié)締組織和膠原。為了去除這些可能對rna分離造成干擾的蛋白，需要使用蛋白酶或含*的裂解試劑對此類樣本進(jìn)行處理。不過，蛋白酶的消化過程需要避免rna發(fā)生降解。
**
**mrna的很多基本特征都不同于真核生物的mrna。原核生物的mrna沒有5’帽子，也很少具有poly a尾。缺少poly a尾的mrna無法通過雜交進(jìn)行捕獲。另外，也無法在合成初始鏈的過程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dt）引物，只能使用隨機引物作為替代。
此外，**rna也十分地不穩(wěn)定，快速生長的品種中rna的平均半衰期約為3分鐘。某些**的mrna在翻譯同時即發(fā)生降解。因此對于嘗試從**中分離mrna的研究人員來說，這可算是個**煩。也由于**中的mrna的周轉(zhuǎn)（從生成到降解）非常快，造成原核生物的基因表達(dá)研究比真核生物更為困難。為了地保留基因表達(dá)譜，并使完好mrna的得率大化，在樣本獲取和加工之前需要對其進(jìn)行穩(wěn)定處理。
血液
血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用rna穩(wěn)定處理試劑可成功保存血液樣本的rna。從血液中分離rna的方法，需要能夠確保生成無污染物或酶抑制劑的質(zhì)量rna。血液中所含有的大量酶抑制劑會對下游的rna分析造成干擾。此外，如肝素和edta等類常規(guī)的抗凝血劑也會干擾下游分析。應(yīng)注意抗凝血劑并不會對rna起到穩(wěn)定化作用。
人類血液中的紅血球（血紅細(xì)胞）不含細(xì)胞核，因此不會合成rna；通常情況下這類細(xì)胞僅含有非常微量的rna，而不是rna分離的主要對象。從全血中分離rna的主要靶標(biāo)細(xì)胞為白血球（白細(xì)胞），這類細(xì)胞含有細(xì)胞核和rna。白血球由三種主要的細(xì)胞類型構(gòu)成：**細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
由于健康的血液中所含的紅細(xì)胞數(shù)量約為白細(xì)胞的1000倍，去除紅細(xì)胞會有助于簡化rna分離步驟。可通過選擇性地裂解紅細(xì)胞來達(dá)到此目的，因為紅細(xì)胞對低滲休克更為敏感（相比白血球），在低滲緩沖液中會迅速發(fā)生破裂。
裂解紅細(xì)胞的另種常見替代方法是ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同，ficoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細(xì)胞（**細(xì)胞和單核細(xì)胞），而會去除粒細(xì)胞。經(jīng)ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細(xì)胞能夠使用與其他動物細(xì)胞樣的方法進(jìn)行rna分離。
ffpe組織樣品
福爾馬林固定，石蠟包埋(ffpe)的組織樣本是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要和廣泛的樣本來源。越來越多的研究者開始針對ffpe樣本開始分子水平的分析，因此考慮這些樣本的*屬性以發(fā)展針對性的分離方法變得越來越重要。
由于在固定和包埋過程中使用了甲醛，通常會使ffpe樣本中的核酸發(fā)生嚴(yán)重的片段化和化學(xué)改變。因此，從ffpe樣本中分離到的核酸會比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類型、保存期長短，以及固定、包埋和儲存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實驗室（lab–on–a–chip）分析等標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制分析中無法測得甲醛修飾情況，但后者實際會對酶學(xué)分析造成嚴(yán)重干擾。
為了將ffpe儲存法對rna轉(zhuǎn)錄物的影響降至低，應(yīng)牢記下列小貼士：
盡可能快地取樣和固定組織不要使用厚度超過5 mm的樣本，樣本固定時間不宜過長（長24小時）使用的試劑進(jìn)行石蠟包埋，不要加入其它添加劑盡可能避免對樣本進(jìn)行染色適當(dāng)?shù)貎Υ鎓fpe樣本（rna在4°c可完好保存至1年，于保存在室溫或更溫度）使用適當(dāng)?shù)拿撌灢襟Erna分離應(yīng)包含個解交聯(lián)的步驟
特定rna病毒
科
病毒
基因組
adenoviridae
adenovirus
dsdna
arenaviridae
lassa virus
ssrna
bornaviridae
borna disease virus
ssrna
bunyaviridae
hantaan virus
ssrna
caliciviridae
hepatitis e virus, norwalk virus
ssrna
filoviridae
ebola virus
ssrna
flaviviridae
hepatitis c and g viruses, dengue virus
ssrna
hepadnaviridae
hepatitis b virus
ss/dsdna
herpesviridae
herpesviruses (hsv; cmv; ebv; hhv6, 7, 8)
dsdna
papovaviridae
human papillomavirus, jc virus
ssdna
paramyxoviridae
parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, rubulavirus
ssrna
parvoviridae
parvovirus b19 (erythrovirus)
ssdna
picornaviridae
coxsackie virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis a virus, poliovirus, rhinovirus
ssrna
reoviridae
rotavirus
dsrna
retroviridae
human foamy virus, human immunodeficiency virus, human t-cell leukemia virus
ssrna
rhabdoviridae
rabies virus
ssrna
rna的儲存
純rna可以儲存在–20°c或–70°c的不含rnase的水中。在上述條件下，1年內(nèi)都不會發(fā)生rna降解。
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起始材料的有效破碎和勻漿對于所有總rna分離操作來說都是必須的要求。破碎和勻漿是兩個獨立分開的步驟。
破碎：對于組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的*破碎對于釋放樣本中所有的rna是必要的。不同樣本需要使用不同的方法以達(dá)到*的破碎效果。不*的破碎會導(dǎo)致rna得率的顯著降低。勻漿：勻漿對于減少破碎后細(xì)胞裂解產(chǎn)物的粘性是十分必要的。勻漿能夠切斷分子量的基因組dna及其他分子量的細(xì)胞組分，得到均勻的裂解產(chǎn)物。勻漿不夠*會導(dǎo)致rna結(jié)合效率的下降而顯著降低得率。某些破碎方法能夠同時對樣本起到勻漿作用，而其他方法還是需要專門的勻漿步驟。表針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準(zhǔn)則**概述了適用于多種起始材料的不同破碎和勻漿方法。當(dāng)您針對所使用的起始材料選擇合適的操作方法時，該表格可用來作為參考。下面也將針對破碎和勻漿方法進(jìn)行更為詳細(xì)的論述。
使用玻珠研磨機進(jìn)行破碎和勻漿
在使用玻珠研磨機破碎樣本的過程中，樣本與珠子被起進(jìn)行速攪拌。通過珠子與細(xì)胞碰撞時的流體動力切割和破碎作用，同步完成破碎和勻漿過程。破碎效率的影響因素有：
珠子的大小和組成緩沖液與珠子的比例起始樣本的數(shù)量攪拌速度和設(shè)定處理時間**破碎時所使用的理想珠型為0.1毫米（平均直徑）的玻璃珠，用于酵母和單細(xì)胞動物細(xì)胞時為0.5毫米的玻璃珠，對動植物組織則應(yīng)使用3–7毫米的不銹鋼珠。請確保玻璃珠經(jīng)過濃硝酸的預(yù)先潤洗。或者可直接購買和使用市售的經(jīng)酸洗滌過的玻璃珠。關(guān)于破碎的其他參數(shù)需要依據(jù)每應(yīng)用的經(jīng)驗進(jìn)行設(shè)定。植物材料以及相關(guān)的珠子和破碎管可先在液氮中預(yù)冷，破碎應(yīng)在無裂解緩沖液的條件下進(jìn)行。對于動物組織則應(yīng)使用干燥的冷凍粉碎。冷凍粉碎（無論是在玻珠研磨機中還是使用研缽和杵）不同于緩沖液裂解，不會對樣本同時起到勻漿作用。
使用轉(zhuǎn)子——定子勻漿器進(jìn)行破碎和勻漿
在裂解緩沖液的存在下，轉(zhuǎn)子–定子勻漿機可同時完成對動物組織的*破碎和勻漿，所需時間基于樣本的堅韌程度，可在5–90秒內(nèi)完成。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機也可以用于細(xì)胞裂解產(chǎn)物的勻漿。轉(zhuǎn)子的超速旋轉(zhuǎn)能夠以擾動和機械剪切的綜合方式，完成對樣本的破碎和勻漿。使用適當(dāng)大小的管子，在勻漿過程中始終保證勻漿器頭部直處于浸沒狀態(tài)，并持續(xù)將勻漿器頭部伸入管子末端，以確保勻漿過程中樣本內(nèi)的泡沫達(dá)到少。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機有不同大小型號可供選擇，并可裝配不同大小的探頭。5 mm和7 mm的探頭適合在300 µl以下的體積內(nèi)使用，并可用于離心管內(nèi)的勻漿。10 mm及以上尺寸的探頭則適用于更大的管子。
使用研缽和杵破碎
使用研缽和杵破碎時，先將樣本進(jìn)行迅速的液氮冷凍，并在液氮中將其研磨為細(xì)粉。將上清液（組織粉末和液氮）轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的適當(dāng)大小的管中，使液氮揮發(fā)但不要讓樣品融解。加入裂解緩沖液，并盡可能快地進(jìn)行后續(xù)步驟。
注：使用研缽和杵研磨樣品會破碎樣品，但無法達(dá)到勻漿的目的。勻漿作用需與此步驟分開進(jìn)行。
使用注射器和針頭完成勻漿
細(xì)胞和組織的裂解產(chǎn)物可以使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿。可以使用20號（0.9 mm）針頭連接個**塑料注射器，通過至少5–10次的吹打切斷分子量的dna，直至裂解產(chǎn)物的勻漿形成。為操作便利和減少樣品損失，也可能需要增加裂解緩沖液的體積。
針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準(zhǔn)則
起始材料
破碎方法
勻漿方法
評論
培養(yǎng)的動物細(xì)胞
加入裂解緩沖液
使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機或注射器和針頭獲取胞質(zhì)rna
如果處理少于1x105個細(xì)胞，可以使用渦動勻漿裂解產(chǎn)物。不勻漿方案。
動物組織
轉(zhuǎn)子–定子勻漿機
轉(zhuǎn)子–定子勻漿機
同步進(jìn)行破碎和勻漿
動物組織
研缽和杵
注射器和針頭
使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機和玻珠研磨機通常比使用研缽和杵的得率更。
動物組織
玻珠研磨機
玻珠研磨機
**
加入裂解緩沖液進(jìn)行酶（*）解
渦旋機
如果處理大于5x108個細(xì)胞，使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿可能會增加得率。
**
玻珠研磨機
玻珠研磨機
玻珠研磨機可同時完成破碎和勻漿；不能使用渦動操作代替玻珠研磨機。
酵母
酶解（*/消解酶）細(xì)胞壁后加入裂解緩沖液，以消化原生質(zhì)球。
渦旋機
酵母
玻珠研磨機
玻珠研磨機
玻珠研磨機可同時完成破碎和勻漿；不能使用渦動操作代替玻珠研磨機。
植物和絲狀**
研缽和杵
注射器和針頭
研缽和杵不能代替轉(zhuǎn)子–定子勻漿機。
從不同樣本來源分離rna的特別注意事項
些樣本來源在其rna或內(nèi)含物方面存在著顯著不同，可能導(dǎo)致rna的分離和分析過程出現(xiàn)問題。當(dāng)操作這些樣本來源時需要些特別注意事項。本節(jié)將針對大量不同樣本來源的操作進(jìn)行探討。
植物
從植物材料中分離rna會遇到些特殊困難，常規(guī)技術(shù)在用于植物樣本之前般要先經(jīng)過條件化。些植物代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)與核酸相似，導(dǎo)致其難于從rna制備產(chǎn)物中除去。（使用不當(dāng)?shù)模┘兓椒ǎㄈ琨}類或*）所導(dǎo)致的代謝物（例如多糖類、多酚類和黃酮類）或污染物與目的rna的共分離，可能造成對酶促反應(yīng)的抑制，或?qū)е伦贤夥止夤舛葴y定和凝膠電泳結(jié)果上的偏差。從植物材料中分離rna的過程中可能遇到的困難還包括由于較粘性導(dǎo)致的吸取體積錯誤，以及儲存過程中的rna降解問題。
通常對植物的生長條件進(jìn)行化，使其不產(chǎn)生水平的植物代謝產(chǎn)物，可有助于對rna的有效分離。由于植物種類之間存在較大差異，因此對其生長條件很難有同的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。不過作為普適原則，建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的rna得率通常于年老組織，因為前者在等重條件下通常比后者包含更多的細(xì)胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外，許多“自定義”的rna分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養(yǎng)1–2天后再進(jìn)行收獲，以避免形成植物代謝物的水平積累。
心臟、肌肉和皮膚組織
從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織類的樣本中分離rna可能比較困難，因為此類樣品中含有大量的收縮性蛋白、結(jié)締組織和膠原。為了去除這些可能對rna分離造成干擾的蛋白，需要使用蛋白酶或含*的裂解試劑對此類樣本進(jìn)行處理。不過，蛋白酶的消化過程需要避免rna發(fā)生降解。
**
**mrna的很多基本特征都不同于真核生物的mrna。原核生物的mrna沒有5’帽子，也很少具有poly a尾。缺少poly a尾的mrna無法通過雜交進(jìn)行捕獲。另外，也無法在合成初始鏈的過程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dt）引物，只能使用隨機引物作為替代。
此外，**rna也十分地不穩(wěn)定，快速生長的品種中rna的平均半衰期約為3分鐘。某些**的mrna在翻譯同時即發(fā)生降解。因此對于嘗試從**中分離mrna的研究人員來說，這可算是個**煩。也由于**中的mrna的周轉(zhuǎn)（從生成到降解）非常快，造成原核生物的基因表達(dá)研究比真核生物更為困難。為了地保留基因表達(dá)譜，并使完好mrna的得率大化，在樣本獲取和加工之前需要對其進(jìn)行穩(wěn)定處理。
血液
血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用rna穩(wěn)定處理試劑可成功保存血液樣本的rna。從血液中分離rna的方法，需要能夠確保生成無污染物或酶抑制劑的質(zhì)量rna。血液中所含有的大量酶抑制劑會對下游的rna分析造成干擾。此外，如肝素和edta等類常規(guī)的抗凝血劑也會干擾下游分析。應(yīng)注意抗凝血劑并不會對rna起到穩(wěn)定化作用。
人類血液中的紅血球（血紅細(xì)胞）不含細(xì)胞核，因此不會合成rna；通常情況下這類細(xì)胞僅含有非常微量的rna，而不是rna分離的主要對象。從全血中分離rna的主要靶標(biāo)細(xì)胞為白血球（白細(xì)胞），這類細(xì)胞含有細(xì)胞核和rna。白血球由三種主要的細(xì)胞類型構(gòu)成：**細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
由于健康的血液中所含的紅細(xì)胞數(shù)量約為白細(xì)胞的1000倍，去除紅細(xì)胞會有助于簡化rna分離步驟。可通過選擇性地裂解紅細(xì)胞來達(dá)到此目的，因為紅細(xì)胞對低滲休克更為敏感（相比白血球），在低滲緩沖液中會迅速發(fā)生破裂。
裂解紅細(xì)胞的另種常見替代方法是ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同，ficoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細(xì)胞（**細(xì)胞和單核細(xì)胞），而會去除粒細(xì)胞。經(jīng)ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細(xì)胞能夠使用與其他動物細(xì)胞樣的方法進(jìn)行rna分離。
ffpe組織樣品
福爾馬林固定，石蠟包埋(ffpe)的組織樣本是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要和廣泛的樣本來源。越來越多的研究者開始針對ffpe樣本開始分子水平的分析，因此考慮這些樣本的*屬性以發(fā)展針對性的分離方法變得越來越重要。
由于在固定和包埋過程中使用了甲醛，通常會使ffpe樣本中的核酸發(fā)生嚴(yán)重的片段化和化學(xué)改變。因此，從ffpe樣本中分離到的核酸會比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類型、保存期長短，以及固定、包埋和儲存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實驗室（lab–on–a–chip）分析等標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制分析中無法測得甲醛修飾情況，但后者實際會對酶學(xué)分析造成嚴(yán)重干擾。
為了將ffpe儲存法對rna轉(zhuǎn)錄物的影響降至低，應(yīng)牢記下列小貼士：
盡可能快地取樣和固定組織不要使用厚度超過5 mm的樣本，樣本固定時間不宜過長（長24小時）使用的試劑進(jìn)行石蠟包埋，不要加入其它添加劑盡可能避免對樣本進(jìn)行染色適當(dāng)?shù)貎Υ鎓fpe樣本（rna在4°c可完好保存至1年，于保存在室溫或更溫度）使用適當(dāng)?shù)拿撌灢襟Erna分離應(yīng)包含個解交聯(lián)的步驟
特定rna病毒
科
病毒
基因組
adenoviridae
adenovirus
dsdna
arenaviridae
lassa virus
ssrna
bornaviridae
borna disease virus
ssrna
bunyaviridae
hantaan virus
ssrna
caliciviridae
hepatitis e virus, norwalk virus
ssrna
filoviridae
ebola virus
ssrna
flaviviridae
hepatitis c and g viruses, dengue virus
ssrna
hepadnaviridae
hepatitis b virus
ss/dsdna
herpesviridae
herpesviruses (hsv; cmv; ebv; hhv6, 7, 8)
dsdna
papovaviridae
human papillomavirus, jc virus
ssdna
paramyxoviridae
parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, rubulavirus
ssrna
parvoviridae
parvovirus b19 (erythrovirus)
ssdna
picornaviridae
coxsackie virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis a virus, poliovirus, rhinovirus
ssrna
reoviridae
rotavirus
dsrna
retroviridae
human foamy virus, human immunodeficiency virus, human t-cell leukemia virus
ssrna
rhabdoviridae
rabies virus
ssrna
rna的儲存
純rna可以儲存在–20°c或–70°c的不含rnase的水中。在上述條件下，1年內(nèi)都不會發(fā)生rna降解。
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