體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗方法！
體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗方法！
百歐博偉生物：在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞暴露于受試樣品中。用中期分裂象阻斷劑（如秋水仙素）處理，使細(xì)胞停止在中期分裂象，隨后收獲細(xì)胞、制片、染色、分析染色體畸變。通過檢測受試樣品誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞染色體畸變的能力，從而評價受試樣品的致突變性及其強度。
一、材料
⒈受試樣品固體受試樣品應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶劑中，并稀釋至一定濃度。液體受試樣品可直接使用或予以稀釋。受試樣品應(yīng)在使用前新鮮配制，否則必須證實儲存不影響其穩(wěn)定性。
⒉陽性對照可根據(jù)受試樣品的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽性對照物，應(yīng)是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復(fù)的陽性結(jié)果。當(dāng)不存在外源性代謝活化系統(tǒng)時，可使用的陽性對照物有甲磺酸甲酯( methyl methanesulphonate, mms )、甲磺酸乙脂（ethyl methanesulpho-nate, ems)、(mytomycin c )、乙基亞( ethyl nitrosourea, enu)、硝基喹啉-n-氧化物（4-nitroquinoline-n-oxide）等。當(dāng)存在外源性活化系統(tǒng)時，可使的陽性對照物有苯并（a)芘（benzo (a) pyrene，bap )、*（cyclophosphamide）等。
⒊陰性對照水或水溶性溶劑，亦可使用二甲基亞砜(dmso)，但濃度不應(yīng)大于0.5%。
⒋細(xì)胞株可選用中國地鼠肺（chl)細(xì)胞株或卵巢（cho）細(xì)胞株、人或其他哺乳動物外周血淋巴細(xì)胞。
⒌肝混合功能氧化酶混合液（s9混合液）。
⒍0.04％秋水仙素溶液。取40mg秋水仙素溶解于100m1無菌0.85%氯化鈉溶液中，過濾除菌。
⒎0.075mol/l溶液
⒏固定液甲醇：冰醋酸=3:1，臨用前配制。
⒐吉姆薩染液取吉姆薩染料3.8g，置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375 ml，待*溶解后，再加125 ml甘油，放入37℃溫箱中保溫48小時。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾,2周后使用，作為吉姆薩染液原液。使用時，取1份吉姆薩染液原液，與9份1/15mol/l磷酸鹽緩沖液（ph 6.8)混合。
⒑磷酸鹽緩沖液（1/15mol/l, ph 6.8)。使用時，取1份吉姆薩染液原液，與9份1/15mo1/l磷酸鹽緩沖液（ph 6.8 )混合，配成其應(yīng)用液。
二、方法
⒈細(xì)胞培養(yǎng)與染毒。試驗需在加入和不加入s9的條件下進行。試驗前一天，將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中，放c02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。試驗時吸去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試樣品、s9混合液（不加s9混合液時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，放培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞周期決定處理2～6小時。結(jié)束后，吸去含受試樣品的培養(yǎng)液，用hanks液洗細(xì)胞3次，加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于24小時內(nèi)收獲細(xì)胞。于收獲前2～4小時，加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時間為4小時，終濃度為1ug/ml)。
⒉用0.25％*溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫落后，加入含10％胎牛或小牛血清的培養(yǎng)液終止*的作用，混勻，放入離心管以1000～1200r/min的速度離心5～7分鐘，棄去上清液。
⒊加入0.075mol/l kcl溶液7ml，用滴管將細(xì)胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲處理7分鐘，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸3：1)混勻，以1500r/min速度離心5～7分鐘，棄去上清液。
⒋加入7 ml固定液，混勻后固定7分鐘，以1500r/min速度離心7分鐘，棄去上清液。用同法再固定1～2次，棄去上清液。
⒌加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。用吉姆薩染液染色。
⒍選擇 100個分散良好的中期分裂象，在顯微鏡油鏡下進行讀片。在讀片時應(yīng)記錄每一觀察細(xì)胞的染色體數(shù)目，對于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視標(biāo)位置及畸變類型。所有處理組、陽性和陰性對照組均需測定有絲分裂指數(shù)。每一劑量組應(yīng)分析不少于500個分散良好的中期分裂象。
三、結(jié)果與分析
計算指標(biāo)包括每個細(xì)胞畸變數(shù)、染色體結(jié)構(gòu)異常百分率、各劑量組及對照組不同類型染色體異常數(shù)與頻率等。分裂細(xì)胞數(shù)應(yīng)分別統(tǒng)計，一般不包括在總異常頻率中。
在下列兩種情況下可判定受試樣品在本試驗系統(tǒng)中為陽性結(jié)果：①受試樣品引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有與劑量相關(guān)的增加；②受試樣品在任何一個劑量條件下，引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有可重復(fù)性。
陰性結(jié)果的判定需在％rs<20%（即已產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性）的情況下未見染色體畸變率顯著增加時方可作出。評價時應(yīng)綜合考慮生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)意義。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的中國微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺，并且是集微生物菌種、菌種,atcc菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！
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⒊陰性對照水或水溶性溶劑，亦可使用二甲基亞砜(dmso)，但濃度不應(yīng)大于0.5%。
⒋細(xì)胞株可選用中國地鼠肺（chl)細(xì)胞株或卵巢（cho）細(xì)胞株、人或其他哺乳動物外周血淋巴細(xì)胞。
⒌肝混合功能氧化酶混合液（s9混合液）。
⒍0.04％秋水仙素溶液。取40mg秋水仙素溶解于100m1無菌0.85%氯化鈉溶液中，過濾除菌。
⒎0.075mol/l溶液
⒏固定液甲醇：冰醋酸=3:1，臨用前配制。
⒐吉姆薩染液取吉姆薩染料3.8g，置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375 ml，待*溶解后，再加125 ml甘油，放入37℃溫箱中保溫48小時。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾,2周后使用，作為吉姆薩染液原液。使用時，取1份吉姆薩染液原液，與9份1/15mol/l磷酸鹽緩沖液（ph 6.8)混合。
⒑磷酸鹽緩沖液（1/15mol/l, ph 6.8)。使用時，取1份吉姆薩染液原液，與9份1/15mo1/l磷酸鹽緩沖液（ph 6.8 )混合，配成其應(yīng)用液。
二、方法
⒈細(xì)胞培養(yǎng)與染毒。試驗需在加入和不加入s9的條件下進行。試驗前一天，將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中，放c02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。試驗時吸去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試樣品、s9混合液（不加s9混合液時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，放培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞周期決定處理2～6小時。結(jié)束后，吸去含受試樣品的培養(yǎng)液，用hanks液洗細(xì)胞3次，加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于24小時內(nèi)收獲細(xì)胞。于收獲前2～4小時，加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時間為4小時，終濃度為1ug/ml)。
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⒊加入0.075mol/l kcl溶液7ml，用滴管將細(xì)胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲處理7分鐘，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸3：1)混勻，以1500r/min速度離心5～7分鐘，棄去上清液。
⒋加入7 ml固定液，混勻后固定7分鐘，以1500r/min速度離心7分鐘，棄去上清液。用同法再固定1～2次，棄去上清液。
⒌加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。用吉姆薩染液染色。
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在下列兩種情況下可判定受試樣品在本試驗系統(tǒng)中為陽性結(jié)果：①受試樣品引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有與劑量相關(guān)的增加；②受試樣品在任何一個劑量條件下，引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有可重復(fù)性。
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