人胰島素原(PI)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明
人胰島素原(pi)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明
pi簡介：
胰島素原(pi)是胰島素的前體激素，它是由由胰島β細胞合成和分泌，主要在腎臟分解代謝。生理情況下，只有極少量的胰島素原釋放入血，在病理情況下，胰島β細胞釋放胰島素原增多，血中胰島素原水平升高。它是細胞在裂解成成熟胰島素之前分泌的最后一個單鏈蛋白結構。它是由芝加哥大學的donald f. steiner教授在1967年發現的。
實驗原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（elisa）。往預先包被有人胰島素原（pi）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，hrp酶結合物，中間經過溫育和洗滌，用底物tmb顯色，tmb在過氧化物酶(hrp)的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素原（pi）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（od值），計算樣品濃度。
試劑盒組成：
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
預包被96孔酶標板
pre-coated assay plate
8孔×12條
8孔×6條
無
標準品
standard
2支
1支
按說明書進行稀釋
通用稀釋液
universal diluent
2x20ml
1x20ml
無
濃縮生物素化檢抗100×
bipiin-antibody(100×)
120μl
60μl
按說明書進行稀釋
濃縮酶結合物100×
streptavidin-hrp(100×)
120μl
60μl
按說明書進行稀釋
20×洗滌液
wash buffer(20×)
2x10ml
1x10ml
按說明書進行稀釋
底物（tmb）
tmb substrate
10ml
5ml
無
終止液
stop solution
6ml
3ml
無
封板膜
plate sealer
4張
4張
無
說明書
pitruction manual
1份
1份
無
試劑盒參數：
性能
靈敏度
4.9 pg/ml
檢測范圍
12.5-800pg/ml
特異性
可檢測樣本中人的pi，且與其類似物無明顯交叉反應
需自備的設備及試劑：
1. 450±10nm 濾光片酶標儀
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul.
3. eppendorf 移液器.
4. 蒸餾水或去離子水.
5. 脫脂棉吸水紙.
6. 37℃恒溫箱.
8. 準備若干個標準品稀釋管.
樣本稀釋方案：
請提前預估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：
稀釋 100 倍 ：一步稀釋。取 5μl 樣本到 495μl 通用稀釋液內 ，做 100 倍稀釋；
稀釋 1000 倍： 兩步稀釋 。 取 5μl 樣本到 95μl 通用稀釋液內 ，做 20 倍稀 釋 ，再取 5μl 20 倍稀釋樣本到 245μl 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 1000 倍；
稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μl 樣本到 195μl 通用稀釋液內 ，做 40 倍 稀釋 ，再取 5μl 40 倍稀釋樣本到 245μl 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，最后 取 5μl 2000 倍稀釋樣本到 245μl 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋100000 倍；
每步稀釋時取液量不少于 3μl ，稀釋倍數不超過 100 倍。每步稀釋都需混合均勻 ，避免起泡。
樣本處理及要求：
1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.血漿：用edta或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.組織勻漿：用預冷的pbs (0.01m, ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9ml的pbs，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
6.樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。
7.樣品保存：樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
檢測前準備工作：
1.請提10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
標準品梯度工作液配制：加入1ml通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為800pg/ml)，然后按照以下濃度：800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、0pg/ml進行稀釋。
倍比稀釋方法：取7支ep管，每管中加入500μl通用稀釋液,200pg/ml的標準品工作液中吸取500μl到第一支ep管中混勻配成100pg/ml的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數第二管中吸取液體，具體如下圖。
1.生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例：10μl濃縮液+990μl通用稀釋液)，當日使用。
2.酶結合物工作液配制：使用前15分鐘將100x濃縮酶結合物于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮hrp酶結合物稀釋成1×工作濃度(例：10μl濃縮液+990μl通用稀釋液)，當日使用。
3.1×洗滌液配制：取10ml20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可放置室溫，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置)。
操作步驟：
1.從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl每孔加入相應孔中，空白孔加入100μl通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減少基質效應對測試結果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。
3.加生物素化抗體：取出酶標板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μl，蓋上封板膜后37℃溫育1小時。
4.洗板：棄去液體，每孔加入300μl 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。
5.加酶結合物工作液：每孔加入酶結合物工作液100μl，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。
6.洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法，洗板5次。
7.加底物：每孔加入底物(tmb)90μl，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。
8. 加終止液：取出酶標板，每孔直接加入終止液50μl，立即在450nm波長處測定各孔的od值。
結果判斷：
1.計算標準品和樣本復孔的平均od值并減去空白孔的od值作為校正值。以濃度為橫坐標，od值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。
2.若樣品od值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
典型數據和參考曲線：
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。
濃度（pg/ml)
800
400
200
100
50
25
12.5
0
od值
2.32
1.93
1.31
0.85
0.51
0.39
0.28
0.1
校正od值
2.22
1.83
1.21
0.75
0.41
0.29
0.18
-
試劑盒性能：
1.重復性：板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。
2.回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入3個不同濃度水平的人pi，計算回收率
樣本類型
范圍
平均回收率
血清（n=8)
84-101
96
血漿(n=8)
92-105
102
細胞培養上清(n=8)
96-108
105
3.線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人pi，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。評估線性。
稀釋比例
回收率（%）
血清
血漿
細胞培養上清
1：2
范圍（%）
84-95
88-96
90-110
平均回收率（%）
91
93
96
1：4
范圍（%）
89-103
87-108
105-115
平均回收率（%）
94
98
109
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胰島素原(pi)是胰島素的前體激素，它是由由胰島β細胞合成和分泌，主要在腎臟分解代謝。生理情況下，只有極少量的胰島素原釋放入血，在病理情況下，胰島β細胞釋放胰島素原增多，血中胰島素原水平升高。它是細胞在裂解成成熟胰島素之前分泌的最后一個單鏈蛋白結構。它是由芝加哥大學的donald f. steiner教授在1967年發現的。
實驗原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（elisa）。往預先包被有人胰島素原（pi）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，hrp酶結合物，中間經過溫育和洗滌，用底物tmb顯色，tmb在過氧化物酶(hrp)的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素原（pi）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（od值），計算樣品濃度。
試劑盒組成：
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
預包被96孔酶標板
pre-coated assay plate
8孔×12條
8孔×6條
無
標準品
standard
2支
1支
按說明書進行稀釋
通用稀釋液
universal diluent
2x20ml
1x20ml
無
濃縮生物素化檢抗100×
bipiin-antibody(100×)
120μl
60μl
按說明書進行稀釋
濃縮酶結合物100×
streptavidin-hrp(100×)
120μl
60μl
按說明書進行稀釋
20×洗滌液
wash buffer(20×)
2x10ml
1x10ml
按說明書進行稀釋
底物（tmb）
tmb substrate
10ml
5ml
無
終止液
stop solution
6ml
3ml
無
封板膜
plate sealer
4張
4張
無
說明書
pitruction manual
1份
1份
無
試劑盒參數：
性能
靈敏度
4.9 pg/ml
檢測范圍
12.5-800pg/ml
特異性
可檢測樣本中人的pi，且與其類似物無明顯交叉反應
需自備的設備及試劑：
1. 450±10nm 濾光片酶標儀
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul.
3. eppendorf 移液器.
4. 蒸餾水或去離子水.
5. 脫脂棉吸水紙.
6. 37℃恒溫箱.
8. 準備若干個標準品稀釋管.
樣本稀釋方案：
請提前預估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：
稀釋 100 倍 ：一步稀釋。取 5μl 樣本到 495μl 通用稀釋液內 ，做 100 倍稀釋；
稀釋 1000 倍： 兩步稀釋 。 取 5μl 樣本到 95μl 通用稀釋液內 ，做 20 倍稀 釋 ，再取 5μl 20 倍稀釋樣本到 245μl 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 1000 倍；
稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μl 樣本到 195μl 通用稀釋液內 ，做 40 倍 稀釋 ，再取 5μl 40 倍稀釋樣本到 245μl 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，最后 取 5μl 2000 倍稀釋樣本到 245μl 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋100000 倍；
每步稀釋時取液量不少于 3μl ，稀釋倍數不超過 100 倍。每步稀釋都需混合均勻 ，避免起泡。
樣本處理及要求：
1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.血漿：用edta或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.組織勻漿：用預冷的pbs (0.01m, ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9ml的pbs，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
6.樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。
7.樣品保存：樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
檢測前準備工作：
1.請提10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
標準品梯度工作液配制：加入1ml通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為800pg/ml)，然后按照以下濃度：800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、0pg/ml進行稀釋。
倍比稀釋方法：取7支ep管，每管中加入500μl通用稀釋液,200pg/ml的標準品工作液中吸取500μl到第一支ep管中混勻配成100pg/ml的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數第二管中吸取液體，具體如下圖。
1.生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例：10μl濃縮液+990μl通用稀釋液)，當日使用。
2.酶結合物工作液配制：使用前15分鐘將100x濃縮酶結合物于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮hrp酶結合物稀釋成1×工作濃度(例：10μl濃縮液+990μl通用稀釋液)，當日使用。
3.1×洗滌液配制：取10ml20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可放置室溫，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置)。
操作步驟：
1.從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl每孔加入相應孔中，空白孔加入100μl通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減少基質效應對測試結果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。
3.加生物素化抗體：取出酶標板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μl，蓋上封板膜后37℃溫育1小時。
4.洗板：棄去液體，每孔加入300μl 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。
5.加酶結合物工作液：每孔加入酶結合物工作液100μl，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。
6.洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法，洗板5次。
7.加底物：每孔加入底物(tmb)90μl，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。
8. 加終止液：取出酶標板，每孔直接加入終止液50μl，立即在450nm波長處測定各孔的od值。
結果判斷：
1.計算標準品和樣本復孔的平均od值并減去空白孔的od值作為校正值。以濃度為橫坐標，od值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。
2.若樣品od值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
典型數據和參考曲線：
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。
濃度（pg/ml)
800
400
200
100
50
25
12.5
0
od值
2.32
1.93
1.31
0.85
0.51
0.39
0.28
0.1
校正od值
2.22
1.83
1.21
0.75
0.41
0.29
0.18
-
試劑盒性能：
1.重復性：板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。
2.回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入3個不同濃度水平的人pi，計算回收率
樣本類型
范圍
平均回收率
血清（n=8)
84-101
96
血漿(n=8)
92-105
102
細胞培養上清(n=8)
96-108
105
3.線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人pi，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。評估線性。
稀釋比例
回收率（%）
血清
血漿
細胞培養上清
1：2
范圍（%）
84-95
88-96
90-110
平均回收率（%）
91
93
96
1：4
范圍（%）
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