CLiM™技術(shù)——CLiM™親和標(biāo)簽系統(tǒng)簡介
clim™親和標(biāo)簽系統(tǒng)clim™親和標(biāo)簽系統(tǒng)基于兩種小蛋白質(zhì)之間形成的超高親和力復(fù)合物。 cl7 (16 kda) 是與靶蛋白融合的標(biāo)簽，lm7 (10 kda) 是與瓊脂糖樹脂偶聯(lián)的配體。
cl7 的 wt 版本是 ce7 dnase，一種有毒細菌蛋白。工程突變消除了其 dna 結(jié)合和 dnase 活性，同時保留了與 lm7 的超高親和力。
成分cl7標(biāo)簽cl7 標(biāo)簽可以表達在目標(biāo)蛋白的 n 或 c 末端。我們的質(zhì)粒提供溶解度標(biāo)簽、親和標(biāo)簽和切割位點的組合以及多種克隆選項。
在對照實驗中，cl7 對溶解度或表達沒有表現(xiàn)出負面影響。事實上，當(dāng)在沒有標(biāo)簽的大腸桿菌中表達時，cl7 提高了原本不溶的蛋白質(zhì)的表達水平和溶解度。當(dāng)用 cl7 標(biāo)簽表達時，一些臨床和治療相關(guān)的蛋白質(zhì)從不溶性部分轉(zhuǎn)移到可溶性部分。純化可溶表達的蛋白質(zhì)不需要變性劑或包涵體重折疊。這些蛋白質(zhì)在基于細胞的測定中表現(xiàn)出與其他商業(yè)/臨床樣品相同的生物活性。
im7樹脂lm7 樹脂由固定在瓊脂糖樹脂上的 cl7 結(jié)合伴侶 lm7 組成。 lm7 和 cl7 之間的高度特異性親和力導(dǎo)致樹脂脫靶最小化。 35-40 mg/ml 的高樹脂結(jié)合能力可以捕獲大量 cl7 標(biāo)記的蛋白質(zhì)。 lm7 結(jié)構(gòu)域具有高度彈性：使用 gdn-hci，樹脂可以再生并重復(fù)使用多達 100 次。
洗脫蛋白酶蛋白酶對于從 lm7 樹脂柱上洗脫目標(biāo)蛋白至關(guān)重要。 trialtus 生產(chǎn)自己的高活性、超高親和力純度的 sumo 和 psc 蛋白酶。這兩種 trialtus 蛋白酶的裂解速度比競爭對手的產(chǎn)品更快，而且成本更低。
例如，如果 60-80 mg 蛋白質(zhì)與 5 ml 柱結(jié)合，則 1 mg 蛋白酶溶于 20 ml 洗脫緩沖液中，流速為 0.2 ml/min，只需 1.5-2 小時即可洗脫蛋白質(zhì)。少量的蛋白酶太稀了，可能不需要去除。如果需要，可以使用用于 sumo 的鎳柱和用于 psc 的谷胱甘肽來執(zhí)行拋光步驟。
sumo
sumo 蛋白酶用于洗脫 n 末端標(biāo)記蛋白。這種高度特異性的酶可識別 sumo 結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)并切割其 c 端，切割后不留下任何氨基酸殘基。其特異性使其切割速度比 psc 更快。 4°c 下，1μg sumo 在 30 分鐘內(nèi)將 2 mg 底物裂解 96%，在 40 分鐘內(nèi)裂解 99%。
pscpsc 蛋白酶用于切割 n 或 c 末端標(biāo)記的蛋白質(zhì)。它也非常高效：在 4 °c 下，20μgpsc 將在 40 分鐘內(nèi)以 91% 的速度裂解 2 mg 底物，在 60 分鐘內(nèi)以 99% 的速度裂解。
一步層析純化方案cl7 和 im7 的鹽獨立性和高度特異性的結(jié)合親和力可實現(xiàn)簡單且簡化的實驗方案。 cl7 不是使用 his-trap 作為第一步，然后使用特殊標(biāo)簽來精煉蛋白質(zhì)，而是通過一個色譜步驟即可實現(xiàn)超高純度。
優(yōu)點蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)根據(jù)其在兩個參數(shù)下的性能進行評估：產(chǎn)量和純度。clim™ 親和標(biāo)簽系統(tǒng)在兩個賬戶上的表現(xiàn)都優(yōu)于 his 標(biāo)簽和特殊標(biāo)簽。
屈服trialtus 的高結(jié)合能力樹脂的高效偶聯(lián)方法遠遠優(yōu)于其他專用標(biāo)簽的樹脂。 lm7 6b 樹脂的結(jié)合能力在 35-40 mg/ml 范圍內(nèi)，4b 樹脂的結(jié)合能力 >60 mg/ml。
純度
蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)可達到的純度取決于其對未標(biāo)記細胞成分的敏感性。雜質(zhì)類型包括基于標(biāo)記靶蛋白/細胞成分相互作用的雜質(zhì)以及由于未標(biāo)記細胞成分與柱結(jié)合配體的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的雜質(zhì)。
與靶蛋白的相互作用在高鹽濃度緩沖液存在的情況下，cl7 與 im7 的結(jié)合不受干擾。高鹽緩沖液可在純化過程的早期去除雜質(zhì)，以獲得潔凈的最終產(chǎn)品。特殊標(biāo)簽對約 0.2-0.3 m 的鹽濃度敏感，導(dǎo)致第一個色譜步驟后純度較低。
非特異性結(jié)合cl7 和 im7 彼此具有高度的特異性。這可以防止標(biāo)簽或配體與細胞成分（例如 dna 和其他蛋白質(zhì)）之間的非特異性相互作用。 imac 系統(tǒng)容易與樹脂中的金屬離子發(fā)生非特異性結(jié)合。
高耐鹽性和高特異性結(jié)合的結(jié)合導(dǎo)致了如此高的純度，以至于 cl7/lm7 系統(tǒng)僅需要一個色譜步驟。
純化的具有挑戰(zhàn)性的蛋白質(zhì)多亞基rna聚合酶-ttrnapttrnap（嗜熱菌rna 聚合酶）是一種約 400 kda 的大蛋白，具有 5 個亞基 (α2ββ'ω) 和 4 個結(jié)合位點。傳統(tǒng)上，純化需要五個連續(xù)的層析步驟才能獲得足夠高的純度以實現(xiàn)高活性。蛋白質(zhì)純度與其活性直接相關(guān)。將細胞裂解物裝入 1.5 m 鹽緩沖液中是一步純度的關(guān)鍵。 cl7 標(biāo)簽僅附著在最大的β' 亞基上，不會干擾亞基組裝。
dna/rna 結(jié)合蛋白 - cas9cas9是crispr技術(shù)的重要組成部分。 cas9 活性與其純度直接相關(guān)，但通常需要 4-5 個色譜步驟才能達到所需的純度。 cas9 帶有 cl7 標(biāo)簽并加載在 1.5 m 鹽緩沖液中，一步純化即可達到 99% 的純度。該酶在細胞檢測和體外檢測中均顯示出高活性。
膜蛋白-yidcyidc 是一種~32 kda 細菌膜整合酶。膜蛋白很難純化，因為與細胞成分的疏水接觸會造成污染。由于組氨酸標(biāo)簽非特異性地結(jié)合到其柱上，因此在一步純化后會出現(xiàn)大量雜質(zhì)。 cl7 對 im7 的特異性最大限度地減少了這些影響，使純度高達 99%。
折疊不良的治療蛋白 - gcsf、hgh 和 ifn-αfda 批準(zhǔn)的三種生物制劑——gcsf、hgh 和 ifn-α——各自具有兩個內(nèi)部半胱氨酸橋，在沒有標(biāo)簽的大腸桿菌中表達時通常不溶。純化不溶性蛋白質(zhì)通常涉及棘手的重折疊步驟，然后是多個色譜步驟。 cl7 增強蛋白質(zhì)的表達、穩(wěn)定性和折疊，使它們不再以包涵體形式表達。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與基于細胞的陣列中的其他商業(yè)/臨床樣品相當(dāng)?shù)纳锘钚浴?br>
逆轉(zhuǎn)錄酶（RT-PCR）實驗操作流程及注意事項
安徽省城市污水管網(wǎng)整治攻堅行動方案（2023—2025年）出爐
【小課堂】 徠卡 IPC/IPS打號機日常保養(yǎng)和注意事項
介電常數(shù)測試儀新技術(shù)使得測量技術(shù)更精準(zhǔn)
助力機械手系統(tǒng)的分類
CLiM™技術(shù)——CLiM™親和標(biāo)簽系統(tǒng)簡介
拉力試驗機試驗速率的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定
瀝青抽提三氯乙烯回收儀技術(shù)指標(biāo)結(jié)構(gòu)特點操作規(guī)程
智慧消防是智慧城市建設(shè)的主要因素之一——樂鳥
YC71-SYC-1降雨降塵采集器技術(shù)資料
混凝土標(biāo)準(zhǔn)恒溫恒濕養(yǎng)護箱升溫和降溫由什么調(diào)控
寧波富強鑫獲批寧波市專精特新“小巨人”重點培育企業(yè)
關(guān)于美Beswick調(diào)壓閥PRD2系列特點及產(chǎn)品用途
實驗室超純水機管道清洗
電磁閥常見故障有哪些及處理方式
B級刻度移液管的維護和保養(yǎng)非常重要
煙臺牙科醫(yī)院污水處理設(shè)備
大蒜分瓣機的產(chǎn)品特點
快遞業(yè)綠色包裝指南發(fā)布：要求逐步實現(xiàn)包材減量化
一體化生物污水處理設(shè)施
cl7 的 wt 版本是 ce7 dnase，一種有毒細菌蛋白。工程突變消除了其 dna 結(jié)合和 dnase 活性，同時保留了與 lm7 的超高親和力。
成分cl7標(biāo)簽cl7 標(biāo)簽可以表達在目標(biāo)蛋白的 n 或 c 末端。我們的質(zhì)粒提供溶解度標(biāo)簽、親和標(biāo)簽和切割位點的組合以及多種克隆選項。
在對照實驗中，cl7 對溶解度或表達沒有表現(xiàn)出負面影響。事實上，當(dāng)在沒有標(biāo)簽的大腸桿菌中表達時，cl7 提高了原本不溶的蛋白質(zhì)的表達水平和溶解度。當(dāng)用 cl7 標(biāo)簽表達時，一些臨床和治療相關(guān)的蛋白質(zhì)從不溶性部分轉(zhuǎn)移到可溶性部分。純化可溶表達的蛋白質(zhì)不需要變性劑或包涵體重折疊。這些蛋白質(zhì)在基于細胞的測定中表現(xiàn)出與其他商業(yè)/臨床樣品相同的生物活性。
im7樹脂lm7 樹脂由固定在瓊脂糖樹脂上的 cl7 結(jié)合伴侶 lm7 組成。 lm7 和 cl7 之間的高度特異性親和力導(dǎo)致樹脂脫靶最小化。 35-40 mg/ml 的高樹脂結(jié)合能力可以捕獲大量 cl7 標(biāo)記的蛋白質(zhì)。 lm7 結(jié)構(gòu)域具有高度彈性：使用 gdn-hci，樹脂可以再生并重復(fù)使用多達 100 次。
洗脫蛋白酶蛋白酶對于從 lm7 樹脂柱上洗脫目標(biāo)蛋白至關(guān)重要。 trialtus 生產(chǎn)自己的高活性、超高親和力純度的 sumo 和 psc 蛋白酶。這兩種 trialtus 蛋白酶的裂解速度比競爭對手的產(chǎn)品更快，而且成本更低。
例如，如果 60-80 mg 蛋白質(zhì)與 5 ml 柱結(jié)合，則 1 mg 蛋白酶溶于 20 ml 洗脫緩沖液中，流速為 0.2 ml/min，只需 1.5-2 小時即可洗脫蛋白質(zhì)。少量的蛋白酶太稀了，可能不需要去除。如果需要，可以使用用于 sumo 的鎳柱和用于 psc 的谷胱甘肽來執(zhí)行拋光步驟。
sumo
sumo 蛋白酶用于洗脫 n 末端標(biāo)記蛋白。這種高度特異性的酶可識別 sumo 結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)并切割其 c 端，切割后不留下任何氨基酸殘基。其特異性使其切割速度比 psc 更快。 4°c 下，1μg sumo 在 30 分鐘內(nèi)將 2 mg 底物裂解 96%，在 40 分鐘內(nèi)裂解 99%。
pscpsc 蛋白酶用于切割 n 或 c 末端標(biāo)記的蛋白質(zhì)。它也非常高效：在 4 °c 下，20μgpsc 將在 40 分鐘內(nèi)以 91% 的速度裂解 2 mg 底物，在 60 分鐘內(nèi)以 99% 的速度裂解。
一步層析純化方案cl7 和 im7 的鹽獨立性和高度特異性的結(jié)合親和力可實現(xiàn)簡單且簡化的實驗方案。 cl7 不是使用 his-trap 作為第一步，然后使用特殊標(biāo)簽來精煉蛋白質(zhì)，而是通過一個色譜步驟即可實現(xiàn)超高純度。
優(yōu)點蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)根據(jù)其在兩個參數(shù)下的性能進行評估：產(chǎn)量和純度。clim™ 親和標(biāo)簽系統(tǒng)在兩個賬戶上的表現(xiàn)都優(yōu)于 his 標(biāo)簽和特殊標(biāo)簽。
屈服trialtus 的高結(jié)合能力樹脂的高效偶聯(lián)方法遠遠優(yōu)于其他專用標(biāo)簽的樹脂。 lm7 6b 樹脂的結(jié)合能力在 35-40 mg/ml 范圍內(nèi)，4b 樹脂的結(jié)合能力 >60 mg/ml。
純度
蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)可達到的純度取決于其對未標(biāo)記細胞成分的敏感性。雜質(zhì)類型包括基于標(biāo)記靶蛋白/細胞成分相互作用的雜質(zhì)以及由于未標(biāo)記細胞成分與柱結(jié)合配體的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的雜質(zhì)。
與靶蛋白的相互作用在高鹽濃度緩沖液存在的情況下，cl7 與 im7 的結(jié)合不受干擾。高鹽緩沖液可在純化過程的早期去除雜質(zhì)，以獲得潔凈的最終產(chǎn)品。特殊標(biāo)簽對約 0.2-0.3 m 的鹽濃度敏感，導(dǎo)致第一個色譜步驟后純度較低。
非特異性結(jié)合cl7 和 im7 彼此具有高度的特異性。這可以防止標(biāo)簽或配體與細胞成分（例如 dna 和其他蛋白質(zhì)）之間的非特異性相互作用。 imac 系統(tǒng)容易與樹脂中的金屬離子發(fā)生非特異性結(jié)合。
高耐鹽性和高特異性結(jié)合的結(jié)合導(dǎo)致了如此高的純度，以至于 cl7/lm7 系統(tǒng)僅需要一個色譜步驟。
純化的具有挑戰(zhàn)性的蛋白質(zhì)多亞基rna聚合酶-ttrnapttrnap（嗜熱菌rna 聚合酶）是一種約 400 kda 的大蛋白，具有 5 個亞基 (α2ββ'ω) 和 4 個結(jié)合位點。傳統(tǒng)上，純化需要五個連續(xù)的層析步驟才能獲得足夠高的純度以實現(xiàn)高活性。蛋白質(zhì)純度與其活性直接相關(guān)。將細胞裂解物裝入 1.5 m 鹽緩沖液中是一步純度的關(guān)鍵。 cl7 標(biāo)簽僅附著在最大的β' 亞基上，不會干擾亞基組裝。
dna/rna 結(jié)合蛋白 - cas9cas9是crispr技術(shù)的重要組成部分。 cas9 活性與其純度直接相關(guān)，但通常需要 4-5 個色譜步驟才能達到所需的純度。 cas9 帶有 cl7 標(biāo)簽并加載在 1.5 m 鹽緩沖液中，一步純化即可達到 99% 的純度。該酶在細胞檢測和體外檢測中均顯示出高活性。
膜蛋白-yidcyidc 是一種~32 kda 細菌膜整合酶。膜蛋白很難純化，因為與細胞成分的疏水接觸會造成污染。由于組氨酸標(biāo)簽非特異性地結(jié)合到其柱上，因此在一步純化后會出現(xiàn)大量雜質(zhì)。 cl7 對 im7 的特異性最大限度地減少了這些影響，使純度高達 99%。
折疊不良的治療蛋白 - gcsf、hgh 和 ifn-αfda 批準(zhǔn)的三種生物制劑——gcsf、hgh 和 ifn-α——各自具有兩個內(nèi)部半胱氨酸橋，在沒有標(biāo)簽的大腸桿菌中表達時通常不溶。純化不溶性蛋白質(zhì)通常涉及棘手的重折疊步驟，然后是多個色譜步驟。 cl7 增強蛋白質(zhì)的表達、穩(wěn)定性和折疊，使它們不再以包涵體形式表達。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與基于細胞的陣列中的其他商業(yè)/臨床樣品相當(dāng)?shù)纳锘钚浴?br>
逆轉(zhuǎn)錄酶（RT-PCR）實驗操作流程及注意事項
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介電常數(shù)測試儀新技術(shù)使得測量技術(shù)更精準(zhǔn)
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