GB/T 42114-2022木薯葉片中黃酮醇的測定 高效液相色譜法
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb/t 42114-2022
木薯葉片中黃酮醇的測定高效液相色譜法
determination of flavonol in cassava leaves-
high-performance liquid chromatography
1范圍
本文件描述了木薯(manihot esculenta crantz,cassava)葉中4種黃酮醇化合物的高效液相色譜測定方法。
本文件適用于木薯鮮葉和木薯干葉中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷4種黃酮醇含量的測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)話用于本文件。
gb/t6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
木薯葉片試樣中加入50%乙醇水溶液，經(jīng)超聲波輔助提取，高效液相色譜儀分離，紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測，根據(jù)保留時間定性和外標(biāo)法定量。
5試劑和材料
除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑，以及符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1試劑
5.1.1甲醇(ch3oh，cas號：67-56-1)：色譜純。
5.1.2無水乙醇(ch3ch2oh，cas號：64-17-5)：色譜純。
5.1.3磷酸(h3po4，cas號：7664-38-2)。
5.2試劑配制
5.2.1 50%乙醇水溶液(體積分?jǐn)?shù))：取500 ml無水乙醇(5.1.2)，加入500 ml水，混勻。
5.2.2 0.2%磷酸水溶液(體積分?jǐn)?shù))：取2.0 ml磷酸(5.1.3)，置于1 000 ml容量瓶中，用水定容至刻度，現(xiàn)配現(xiàn)用。
5.3標(biāo)準(zhǔn)品
5.3.1楊梅苷(myricetin-3-o-rutinoside，c27h30o17，cas號：41093-68-9)：純度≥98.0%。
5.3.2蘆丁(quercetin 3-o-rutinoside，c27h30o16，cas號：153-18-4)：純度≥98.0%。
5.3.3煙花苷(kaempferol-3-o-rutinoside，c27h30o15，cas號：17650-84-9)：純度≥98.0%。
5.3.4水仙苷(isorhamnetin-3-o-rutinoside，c28h32o16，cas號：604-80-8)：純度≥98.0%。
5.4標(biāo)準(zhǔn)溶波配制
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液
稱取楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷標(biāo)準(zhǔn)品分別為100.0mg、600.0mg、300.0mg和100.0mg，加甲醇(5.1.1)溶解并定容至100 ml，配成質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/ml、6.0 mg/ml、3.0 mg/ml和1.0 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃密封避光保存。保存期6個月。
5.4.2標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液
分別移取1.0 ml，的楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(5.4.1)于10 ml，棕色容量瓶中，用50%乙醇水溶液(5.2.1)定容，獲得4種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為100.0μg/ml、600.0μg/ ml、300.0μg/ ml、100.0μg/ml標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
5.4.3系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液
準(zhǔn)確移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液(5.4.2)，用50%乙醇水溶液(5.2.1)逐級稀釋，配制成楊梅苷質(zhì)量濃度分別為0.25μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、25.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml，蘆丁質(zhì)量濃度分別為0.15μg/ml、3.0μg/ ml、15.0μg/ ml、30.0μg/ ml、150.0μg/ ml、300.0μg/ ml、600.0μg/ ml，煙花苷質(zhì)量濃度分別為0.15μg/ml、1.5μ/ml、7.5 ug/ml、15.0μg/ml、75.0μg/ml、150.0μg/ ml、300.0μg/ ml，水仙苷質(zhì)量濃度分別為0.15μg/ml、0.5μg/ml、2.5μ/ml、5.0μg/ml、25.0μg/ml、50.0μg/ml，100.0μg/ml的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
6儀器與設(shè)備
6.1高效液相色譜儀：配備紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
6.2天平：感量0.1 mg和0.01 g。
6.3超聲波清洗器：功率≥500 w。
6.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4 200 r/min，配15 ml，轉(zhuǎn)子或適配器。
6.5電熱恒溫干燥箱。
6.6植物組織研磨儀。
6.7旋渦混合器。
6.8離心管：15 ml和50 ml。
6.9容量瓶：10 ml和1 000 ml。
6.10移液管：0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml和1.0 ml。
6.11 ptfe親水微孔濾膜或相當(dāng)性能的濾膜：孔徑0.22μm。
7試樣制備與保存
7.1木薯鮮葉
取適量木薯新鮮葉片(不帶葉柄)。擦拭干凈表面塵土或水分，用液氮速凍后研磨至粉末，裝入潔凈的離心管中。試樣制備后于-18℃以下密封避光保存。保存期1年。
7.2木薯干葉
取適量的木薯干葉(不帶葉柄)，用植物組織研磨儀研磨至粉末，過0.2 mm的篩，混勻，裝入潔凈的密封袋中。試樣制備后于8℃以下密封避光保存。保存期1年。
8測定步驟
8.1提取
準(zhǔn)確稱取木薯鮮葉或木薯干葉粉末0.2g(±0.0002g)于15ml離心管中，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)5.0 ml，旋渦振蕩混勻，超聲提取60 min(50℃，500 w)，離心10 min(4 200 r/min，25℃)，上清液轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，殘渣再加入50%乙醇水溶液(5.2.1)5.0 ml，旋渦振蕩混勻，離心5 min(10000 r/min，25℃)，合并兩次離心的上清液，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)定容至10 ml，旋渦振蕩混勻，即待測樣品溶液。取1.0 ml待測樣品溶液，通過0.22μm微孔濾膜(6.11)，供高效液相色譜儀檢測。
8.2測定
8.2.1色譜參考條件
高效液相色譜儀(6.1)的色譜參考條件如下：
a)c18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)或性能相當(dāng)?shù)纳V柱；
b)流動相：甲醇和0.2%磷酸水溶液，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；
c)流速：0.8 ml/min；
d)檢測波長：360nm；
e)進(jìn)樣量：10μl；
f)柱溫：40℃。
8.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制怍
取適量標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液(5.4.2)，用50%乙醇稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(5.4.3)，楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷質(zhì)量濃度范圍分別為：0.25 mg/l~ 100.0 mg/l、0.15 mg/l~600.0 mg/l、0.15 mg/l~300.0 mg/l和0.15 mg/l~ 100.0 mg/l。按照8.2.1規(guī)定的色譜條件測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見附錄a。
8.2.3試樣溶液的測定：
按照8.2.1規(guī)定的色譜條件，將待測樣品溶液(8.1)注入高效液相色譜儀(6.1)中進(jìn)行測試，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的保留時間進(jìn)行定性。試樣溶液中4種黃酮醇的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。
9結(jié)果計算與表述
9.1木薯葉片中黃酮醇各組分含量
試樣中木薯葉黃酮醇各組分含量，按式(1)計算。
式中：
x——試樣中某一黃酮醇組分含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
ρi——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中各組分的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；
v——試樣提取液定容體積，單位為亳升(ml)；
1000——單位換算系數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；
f——稀釋倍數(shù)。
9.2木薯葉黃酮醇總含量
試樣中黃酮醇總含量為各組分之和，按式(2)計算。
式中：
x——試樣中黃酮醇總含量，單位為毫克每千克( mg/kg)；
xi——試樣中某一黃酮醇組分含量，單位為毫克每千克(mg/kg)。
注：本文件中4種黃酮醇已包括木薯葉片中黃酮醇的絕大部分含量，可視為木薯葉片中黃酮醇總含量。
9.3結(jié)果表示
計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留至小數(shù)點后一位。
10精密度
10.1重復(fù)性
在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的10%。
10.2再現(xiàn)性
在再現(xiàn)性條件下，獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的15%。
11檢出限和定量限
本方法測定黃酮醇的檢出限和定量限見表2。
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gb/t 42114-2022
木薯葉片中黃酮醇的測定高效液相色譜法
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1范圍
本文件描述了木薯(manihot esculenta crantz,cassava)葉中4種黃酮醇化合物的高效液相色譜測定方法。
本文件適用于木薯鮮葉和木薯干葉中楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷4種黃酮醇含量的測定。
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本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
木薯葉片試樣中加入50%乙醇水溶液，經(jīng)超聲波輔助提取，高效液相色譜儀分離，紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測，根據(jù)保留時間定性和外標(biāo)法定量。
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除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑，以及符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1試劑
5.1.1甲醇(ch3oh，cas號：67-56-1)：色譜純。
5.1.2無水乙醇(ch3ch2oh，cas號：64-17-5)：色譜純。
5.1.3磷酸(h3po4，cas號：7664-38-2)。
5.2試劑配制
5.2.1 50%乙醇水溶液(體積分?jǐn)?shù))：取500 ml無水乙醇(5.1.2)，加入500 ml水，混勻。
5.2.2 0.2%磷酸水溶液(體積分?jǐn)?shù))：取2.0 ml磷酸(5.1.3)，置于1 000 ml容量瓶中，用水定容至刻度，現(xiàn)配現(xiàn)用。
5.3標(biāo)準(zhǔn)品
5.3.1楊梅苷(myricetin-3-o-rutinoside，c27h30o17，cas號：41093-68-9)：純度≥98.0%。
5.3.2蘆丁(quercetin 3-o-rutinoside，c27h30o16，cas號：153-18-4)：純度≥98.0%。
5.3.3煙花苷(kaempferol-3-o-rutinoside，c27h30o15，cas號：17650-84-9)：純度≥98.0%。
5.3.4水仙苷(isorhamnetin-3-o-rutinoside，c28h32o16，cas號：604-80-8)：純度≥98.0%。
5.4標(biāo)準(zhǔn)溶波配制
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液
稱取楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷標(biāo)準(zhǔn)品分別為100.0mg、600.0mg、300.0mg和100.0mg，加甲醇(5.1.1)溶解并定容至100 ml，配成質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/ml、6.0 mg/ml、3.0 mg/ml和1.0 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃密封避光保存。保存期6個月。
5.4.2標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液
分別移取1.0 ml，的楊梅苷、蘆丁、煙花苷、水仙苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(5.4.1)于10 ml，棕色容量瓶中，用50%乙醇水溶液(5.2.1)定容，獲得4種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為100.0μg/ml、600.0μg/ ml、300.0μg/ ml、100.0μg/ml標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
5.4.3系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液
準(zhǔn)確移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液(5.4.2)，用50%乙醇水溶液(5.2.1)逐級稀釋，配制成楊梅苷質(zhì)量濃度分別為0.25μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、25.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml，蘆丁質(zhì)量濃度分別為0.15μg/ml、3.0μg/ ml、15.0μg/ ml、30.0μg/ ml、150.0μg/ ml、300.0μg/ ml、600.0μg/ ml，煙花苷質(zhì)量濃度分別為0.15μg/ml、1.5μ/ml、7.5 ug/ml、15.0μg/ml、75.0μg/ml、150.0μg/ ml、300.0μg/ ml，水仙苷質(zhì)量濃度分別為0.15μg/ml、0.5μg/ml、2.5μ/ml、5.0μg/ml、25.0μg/ml、50.0μg/ml，100.0μg/ml的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
6儀器與設(shè)備
6.1高效液相色譜儀：配備紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
6.2天平：感量0.1 mg和0.01 g。
6.3超聲波清洗器：功率≥500 w。
6.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4 200 r/min，配15 ml，轉(zhuǎn)子或適配器。
6.5電熱恒溫干燥箱。
6.6植物組織研磨儀。
6.7旋渦混合器。
6.8離心管：15 ml和50 ml。
6.9容量瓶：10 ml和1 000 ml。
6.10移液管：0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml和1.0 ml。
6.11 ptfe親水微孔濾膜或相當(dāng)性能的濾膜：孔徑0.22μm。
7試樣制備與保存
7.1木薯鮮葉
取適量木薯新鮮葉片(不帶葉柄)。擦拭干凈表面塵土或水分，用液氮速凍后研磨至粉末，裝入潔凈的離心管中。試樣制備后于-18℃以下密封避光保存。保存期1年。
7.2木薯干葉
取適量的木薯干葉(不帶葉柄)，用植物組織研磨儀研磨至粉末，過0.2 mm的篩，混勻，裝入潔凈的密封袋中。試樣制備后于8℃以下密封避光保存。保存期1年。
8測定步驟
8.1提取
準(zhǔn)確稱取木薯鮮葉或木薯干葉粉末0.2g(±0.0002g)于15ml離心管中，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)5.0 ml，旋渦振蕩混勻，超聲提取60 min(50℃，500 w)，離心10 min(4 200 r/min，25℃)，上清液轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，殘渣再加入50%乙醇水溶液(5.2.1)5.0 ml，旋渦振蕩混勻，離心5 min(10000 r/min，25℃)，合并兩次離心的上清液，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)定容至10 ml，旋渦振蕩混勻，即待測樣品溶液。取1.0 ml待測樣品溶液，通過0.22μm微孔濾膜(6.11)，供高效液相色譜儀檢測。
8.2測定
8.2.1色譜參考條件
高效液相色譜儀(6.1)的色譜參考條件如下：
a)c18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)或性能相當(dāng)?shù)纳V柱；
b)流動相：甲醇和0.2%磷酸水溶液，按表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；
c)流速：0.8 ml/min；
d)檢測波長：360nm；
e)進(jìn)樣量：10μl；
f)柱溫：40℃。
8.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制怍
取適量標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液(5.4.2)，用50%乙醇稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(5.4.3)，楊梅苷、蘆丁、煙花苷和水仙苷質(zhì)量濃度范圍分別為：0.25 mg/l~ 100.0 mg/l、0.15 mg/l~600.0 mg/l、0.15 mg/l~300.0 mg/l和0.15 mg/l~ 100.0 mg/l。按照8.2.1規(guī)定的色譜條件測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見附錄a。
8.2.3試樣溶液的測定：
按照8.2.1規(guī)定的色譜條件，將待測樣品溶液(8.1)注入高效液相色譜儀(6.1)中進(jìn)行測試，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的保留時間進(jìn)行定性。試樣溶液中4種黃酮醇的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。
9結(jié)果計算與表述
9.1木薯葉片中黃酮醇各組分含量
試樣中木薯葉黃酮醇各組分含量，按式(1)計算。
式中：
x——試樣中某一黃酮醇組分含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
ρi——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中各組分的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；
v——試樣提取液定容體積，單位為亳升(ml)；
1000——單位換算系數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；
f——稀釋倍數(shù)。
9.2木薯葉黃酮醇總含量
試樣中黃酮醇總含量為各組分之和，按式(2)計算。
式中：
x——試樣中黃酮醇總含量，單位為毫克每千克( mg/kg)；
xi——試樣中某一黃酮醇組分含量，單位為毫克每千克(mg/kg)。
注：本文件中4種黃酮醇已包括木薯葉片中黃酮醇的絕大部分含量，可視為木薯葉片中黃酮醇總含量。
9.3結(jié)果表示
計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留至小數(shù)點后一位。
10精密度
10.1重復(fù)性
在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的10%。
10.2再現(xiàn)性
在再現(xiàn)性條件下，獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的15%。
11檢出限和定量限
本方法測定黃酮醇的檢出限和定量限見表2。
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