整合素 α4β7-MAdCAM-1 相互作用的力依賴機制
淋巴細胞歸巢主要是淋巴細胞表面的歸巢受體與血管內皮細胞表面的黏附分子-血管地址素的相互作用為基礎定向移動的一種遷移活動，是由相關黏附分子相互作用的一個多步級聯反應過程，其中最主要的黏附分子是整合素α4β7。整合素α4β7是一種歸巢受體分子，通過與粘膜血管地址素細胞黏附分子-1（madcam-1）相互作用，可介導循環淋巴細胞在粘膜組織的血管內皮表面的滾動和穩定黏附。在此過程中，產生細胞內鈣信號。鈣信號調節多種淋巴細胞過程，包括淋巴細胞發育、t細胞和b細胞活化、基因轉錄和效應功能。雖然整合素α4β7對于循環淋巴細胞的黏附和遷移至關重要，但整合素α4β7 參與淋巴細胞的鈣反應目前尚不清楚。
整合素 α4β7和 madcam-1 分子間的鍵合和解離，發生在血液環境中，因此該過程除了受內在化學因素的影響外，還受血流剪切應力環境影響。通過g蛋白偶聯受體通路激活整合素α4β7 依賴于流體剪切應力，隨后的鈣信號事件受流動力的影響。因此，尚不清楚外力能否調節整合素 α4β7/madcam-1引發的鈣反應。
細胞內鈣釋放和細胞外鈣內流是增加淋巴細胞內ca2+ 水平的兩種主要機制。然而，細胞質ca2+ 濃度上調的途徑和整合素α4β7介導的鈣反應的參與機制以及參與該信號通路的關鍵分子尚不清楚。迄今為止，許多作為蛋白質-蛋白質相互作用支架的銜接蛋白與整合素從外向內”信號傳導有關。整合素活化蛋白kindlin-3是kindlin家族中白細胞中特異性表達的成員，參與“由內向外”（intside-out）和“從外向內”（outside-in）信號傳導。因此，需要進一步的研究來闡明kindlin-3在整合素α4β7 介導的鈣信號中的作用。
在華南理工大學生物科學與工程學院生物力學研究所、廣東省生物制藥工程技術研究中心（華南理工大學）的一項研究中，使用結合熒光顯微鏡和平行平板流動腔的系統探討了由整合素α4β7 介導的淋巴細胞模型rpmi 8226細胞的細胞間鈣反應。在不同流動剪切應力下整合素α4β7 與madcam-1結合引發的鈣信號事件用延遲時間、峰值時間和峰值鈣強度來描述，研究結果為分子水平上的細胞生理過程提供了新的視角。研究成果發表在 biomolecules 期刊題為“force-regulated calcium signaling of lymphoid cell rpmi 8226 mediated by integrin α4β7/madcam-1 in flow”。
首先，為了研究流體條件下rpmi 8226細胞中整合素α4β7介導的鈣信號，實驗評估了rpmi 8226細胞的穩定黏附和鈣反應。使用平行板流動室與熒光檢測系統（圖1），發現細胞在0.3 dyn/cm2的壁剪切應力下黏附在鋪有madcam-1的底板上。與空白對照組相比，用2% bsa（牛血清白蛋白）處理的底板上細胞的黏附數目顯著減少，可見 2% bsa 基本能阻斷非特異性黏附作用。此外，在底板上鋪有madcam-1加2% bsa 時，穩定黏附的細胞數量增加，且與濃度呈正相關。而當底板的 madcam-1 分子用其抗體 f-6 阻斷時，穩定黏附細胞數量顯著降低。這些結果表明，rpmi 8226 細胞能黏附在鋪有 madcam-1 的底板上是由madcam-1與其受體整合素α4β7 之間的特異性相互作用介導的。
圖1 平行平板流動室與熒光檢測系統相結合的示意圖。深綠色細胞代表穩定粘附在madcam-1底板上的rpmi 8226細胞，其鈣信號被激活。淺綠色細胞僅在底板表面滑動，并包含鈣信號的背景。
接下來，實驗評估了黏附在鋪有2和20 μg/ ml 濃度的madcam-1底板上的rpmi 8226細胞的鈣反應。結果表明，madcam-1的濃度差異對細胞鈣信號的產生有顯著影響。隨著madcam-1密度的增加，rpmi 8226細胞中鈣信號的延遲時間迅速縮短，表明整合素α4β7 和 madcam-1之間的相互作用增強，加速了rpmi 8226細胞的胞質鈣釋放。雖然鈣信號的峰值時間和峰值強度沒有顯著差異，但峰值時間縮短，峰值強度在一定程度上增加。這說明，阻滯整合素α4β7 和 madcam-1的結合可特異性觸發rpmi 8226細胞中的鈣信號，且鈣信號的激發速率取決于madcam-1的濃度。
關于機械調控是否可以通過整合素α4β7 誘導淋巴細胞中的鈣信號仍然存在不確定性。因此，評估了rpmi 8226細胞在0.15、0.30和0.60 dyn/cm2壁剪切應力下黏附在10 g/ml madcam-1底板的鈣響應。結果表明，剪切應力增強了整合素α4β7和 madcam-1結合誘導的rpmi 8226的鈣爆釋（calcium bursting）（圖2 a）。增加壁剪切應力可以減少鈣信號的延遲（圖2 b）。同樣，鈣信號的峰值時間隨著壁剪切應力的增大而減少（圖2 c）。相反，峰值強度（鈣信號的最高量）隨著壁剪切應力的增加而增加（圖2 d）。這些結果表明，由整合素α4β7 和madcam-1的相互作用引發的rpmi 8226的鈣信號受到壁面剪切應力的正向調控，外力可加快鈣信號的爆釋速度，增強鈣信號的強度。
圖2 穩定黏附的rpmi 8226細胞的力調控鈣信號。
在鋪有10 μg/ml madcam-1濃度底板上穩定粘附的 rpmi 8226細胞在0.15、0.30和0.60 dyn/cm2 的剪切應力下，鈣信號的（a）時程、（b）延遲時間、（c）峰值時間和（d）峰值強度。
然后，為了確定鈣爆釋是由胞質鈣釋放還是細胞外鈣內流引起的，用抑制劑2-apb和lacl3分別處理rpmi 8226細胞，以0.30 dyn/cm2的壁剪切應力灌流到流動室中。結果表明，不同抑制劑處理導致鈣信號激活的顯著差異。2-apb處理對延遲時間、峰值時間或峰值強度無顯著影響，提示2-apb阻斷內質網鈣通道不影響rpmi 8226細胞中的鈣信號。然而，lacl3顯著增加了延遲和峰值時間，并削弱了峰值強度。也就是說，由整合素α4β7引發的rpmi 8226細胞中的鈣爆釋可能通過使用lacl3抑制細胞膜上的鈣通道而被削弱和減緩。這些結果表明，整合素α4β7和madcam-1相互作用誘導的鈣信號主要依賴于細胞膜上鈣通道的激活，而不需要鈣釋放。
kindlin-3是整合素信號轉導中的重要銜接劑。然而，kindlin-3協助整合素α4β7激活胞質鈣爆釋的機制仍不清楚。最后，為了確定kindlin-3是否參與整合素α4β7激活的鈣信號過程，在rpmi 8226中敲低了kindlin-3的表達，并在流動條件下檢查了整合素α4β7和 madcam-1相互作用誘導的鈣信號。在穩定轉染的rpmi 8226 細胞系中，kindlin-3 shrna沉默的細胞陽性比例 >90%（圖3 a、b），而且kindlin-3的表達低于未轉染的rpmi 8226細胞（圖3 c）。kindlin-3敲低細胞的典型時間過程顯示鈣信號顯減著弱（圖3 d）。與對照組相比，kindlin-3的敲低顯著延長了rpmi 8226細胞中鈣信號傳導的延遲和峰值時間，同時削弱了峰值強度（圖3 e-g），表明kindlin-3的阻斷可能會干擾由整合素α4β7和 madcam-1相互作用引發的鈣爆釋。這些結果表明，kindlin-3參與由整合素α4β7和 madcam-1之間的相互作用誘導的鈣信號傳導。
圖3 流動條件下沉默kindlin-3對整合素α4β7/madcam-1 復合體介導的rpmi 8226細胞鈣信號的影響。
圖4 整合素α4β7和 madcam-1相互作用誘導循環淋巴細胞鈣信號傳導的潛在機制。整合素α4β7 與madcam-1 的結合在流動條件下通過需要 kindlin-3 的共同途徑誘導穩定粘附的 rpmi 8226 細胞的力依賴性鈣信號，隨后激活鈣內流。
總而言之，該研究發現整合素α4β7 與madcam-1 的結合，通過需要kindlin-3的通路，在穩定粘附的rpmi 8226細胞中導致了力依賴性鈣信號。這些發現為黏附分子介導的細胞內信號通路的機械化學調控機制提供了新的見解，為風險評估、臨床診斷以及炎癥性疾病和癌癥治療的有效性的新概念的發展提供了基礎。
參考文獻：sun d, luo z, kong y, huang r, li q. force-regulated calcium signaling of lymphoid cell rpmi 8226 mediated by integrin α4β7/madcam-1 in flow. biomolecules. 2023 mar 24;13(4):587. doi: 10.3390/biom13040587. pmid: 37189336; pmcid: pmc10135767.
原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37189336/
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！
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圖1 平行平板流動室與熒光檢測系統相結合的示意圖。深綠色細胞代表穩定粘附在madcam-1底板上的rpmi 8226細胞，其鈣信號被激活。淺綠色細胞僅在底板表面滑動，并包含鈣信號的背景。
接下來，實驗評估了黏附在鋪有2和20 μg/ ml 濃度的madcam-1底板上的rpmi 8226細胞的鈣反應。結果表明，madcam-1的濃度差異對細胞鈣信號的產生有顯著影響。隨著madcam-1密度的增加，rpmi 8226細胞中鈣信號的延遲時間迅速縮短，表明整合素α4β7 和 madcam-1之間的相互作用增強，加速了rpmi 8226細胞的胞質鈣釋放。雖然鈣信號的峰值時間和峰值強度沒有顯著差異，但峰值時間縮短，峰值強度在一定程度上增加。這說明，阻滯整合素α4β7 和 madcam-1的結合可特異性觸發rpmi 8226細胞中的鈣信號，且鈣信號的激發速率取決于madcam-1的濃度。
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在鋪有10 μg/ml madcam-1濃度底板上穩定粘附的 rpmi 8226細胞在0.15、0.30和0.60 dyn/cm2 的剪切應力下，鈣信號的（a）時程、（b）延遲時間、（c）峰值時間和（d）峰值強度。
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圖3 流動條件下沉默kindlin-3對整合素α4β7/madcam-1 復合體介導的rpmi 8226細胞鈣信號的影響。
圖4 整合素α4β7和 madcam-1相互作用誘導循環淋巴細胞鈣信號傳導的潛在機制。整合素α4β7 與madcam-1 的結合在流動條件下通過需要 kindlin-3 的共同途徑誘導穩定粘附的 rpmi 8226 細胞的力依賴性鈣信號，隨后激活鈣內流。
總而言之，該研究發現整合素α4β7 與madcam-1 的結合，通過需要kindlin-3的通路，在穩定粘附的rpmi 8226細胞中導致了力依賴性鈣信號。這些發現為黏附分子介導的細胞內信號通路的機械化學調控機制提供了新的見解，為風險評估、臨床診斷以及炎癥性疾病和癌癥治療的有效性的新概念的發展提供了基礎。
參考文獻：sun d, luo z, kong y, huang r, li q. force-regulated calcium signaling of lymphoid cell rpmi 8226 mediated by integrin α4β7/madcam-1 in flow. biomolecules. 2023 mar 24;13(4):587. doi: 10.3390/biom13040587. pmid: 37189336; pmcid: pmc10135767.
原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37189336/
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