紅外線滅菌器是人類染色體標本的制備好幫手
一、實驗目的
掌握人類外周血細胞培養方法及染色體標本的制備方法。觀察人類染色體的形態和數目。
二、實驗原理
血液中的t淋巴細胞在體外培養中經一定劑量的植物血凝素（pha）刺激，可以返幼進行細胞分裂，用秋水仙素積累分裂相，用0.075mol/l-1kci進行低滲后，經固定、染色，可見到分散的染色體。
三、實驗準備
超凈工作臺、紅外線滅菌器（艾本森儀器公司）、（1ml、2ml、5m1）、針頭、培養瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、離心機、定時鐘、試管架、量筒、刻度離心管、冰涼玻片，毛細滴管、恒溫水浴鍋、rpmi1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素（pha）、固定液（甲醇：冰乙酸為3∶1，現用現配）、0.075mol。l-1kci低滲液、giemsa染液、ph6.8磷酸緩沖液、恒溫培養箱、吹風機、粗天平、5％nahco3、顯微鏡。
四、實驗方法與步驟
（一）接種
取500單位/lml的肝素0。2ml濕潤針筒后，取靜脈血1～2ml，轉動針筒以混勻肝素；隨后立即插入滅菌小瓶內，送入超凈工作臺（消毒、滅菌等略），在紅外線滅菌器旁將血液滴入2～3個盛有5ml培養液（4mlrpmil640、lml小牛血清，5mgpha，用5％的nahco3調ph至7.0～7.4）的培養瓶內，每瓶0.2～0.3ml（7號針頭13滴），蓋上橡皮塞，輕輕搖動以混勻。
（二）培養
1．將培養瓶放在37℃恒溫箱內培養72h。
2．在終止培養前2～4h，將0.01％的秋水仙素1～2滴（7號針頭）加入培養瓶內，輕輕搖勻．放回溫箱內，繼續培養2～4h。
（三）收獲
1．用吸管充分吹打瓶壁，吸取培養物移入刻度離心管內，相對離心管平衡后放入離心機，離心8min（1000轉/分），吸去上清液，留下沉淀物。
2．低滲處理：加8ml預溫（370c）的0.075mol。l-1kci低滲液，用吸管打勻使細胞懸
浮于低滲液中，放回37℃恒溫水浴鍋中，靜置15～20min，使白細胞膨脹，染色體分散、
紅細胞解體。
3．預固定：加入固定液1～2ml打勻。
4．再離心：1000轉/分離心8min，吸去上清液，留下沉淀物。
5．固定：沿離心管壁加入新配固定液8ml打勻，固定30min。
6．再離心：1000轉/分離心8min，棄去上清液，留下沉淀物。
7．再固定：再加入新配固定液8ml，打勻，靜置30min。
8．再離心：1000轉/分離心8min，棄去上清液。
9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打勻成細胞懸液。
10．制片：用滴管吸細胞懸液2～3滴，滴在冰水預浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，在酒精燈上過幾次，吹風機吹干或氣干。
11．染色：giemsa染液（原液∶ph6.8磷酸緩沖液為1∶9）染色10min～20min、自來水沖洗、晾干。
（四）鏡檢
低倍鏡下找到分散良好的分裂相后，換高倍鏡、油鏡、認真觀察。
（五）注意事項
1．pha是體外淋巴細胞培養成敗的關鍵問題，因此，要考慮它的質量和濃度。鹽水提取物一般冰凍保存的時間不宜過長，時間長了效價減低。
2．濃度一般用1％～2％，每毫升培養液加0.2～0.4ml；濃度過高可能會導致紅細胞凝集。
3．秋水仙素溶液濃度和處理時間。一般zui終濃度每毫升培養液0.1～0.2μg為宜，作用時間為3～5h，一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關系。如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態特征模糊。
4．培養溫度應嚴格控制在37℃+0.5℃。
5．雙蒸水必須用玻璃蒸餾器制備，ph應在6～7之間。
6．低滲步驟極為重要，關系到染色體分散的好壞，因此，低滲液濃度與低滲的時間應掌握適當。
7．離心機用水平式的，速度不宜過快。速度太快細胞團不易打散，反之分裂相易丟失；固定液應在臨用時新鮮配制，固定一定要、均勻。若打散不夠，則細胞在玻片上易集結。
8．若吹打時用力過猛，細胞易破碎，以致染色體數目不完整；培養液的ph值應掌握在7.4土0.1左右，ph值偏酸發育不良，偏堿時細胞出現輕度固縮。
9．玻璃器皿都要十分干凈、無酸，所用試劑以分析純為好。
10．操作過程應保持高度無菌概念，嚴防細菌和病毒污染；在外周血培養中，pha對淋巴細胞的作用，個體差異較大。同樣方法和條件，分裂相多少及分散情況不一樣。因此，若失敗，應充分考慮到這些因素。
（五）預期實驗結果及分析
將制作好的片子在油鏡下仔細觀察，選擇較好的分裂相進行照相、剪貼、分組，將照片上的核型進行剪貼，寫出實驗報告與實驗結果。
染色體數目為46xx，（xy）為人類正常核型。若某對染色體少了一條（2n-1），細胞染色體數目為45；或某一對染色體多了一條（2n+1），細胞染色體數目為47；若為兩種核型，46，xx/46，xxy稱為嵌合體。以上三種為異常核型。
艾本森的生產的紅外線滅菌器已經在各個實驗廣泛應用，為各個實驗的成功提供了有力的保障。請大家認準abson品牌的紅外線滅菌器。
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三、實驗準備
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四、實驗方法與步驟
（一）接種
取500單位/lml的肝素0。2ml濕潤針筒后，取靜脈血1～2ml，轉動針筒以混勻肝素；隨后立即插入滅菌小瓶內，送入超凈工作臺（消毒、滅菌等略），在紅外線滅菌器旁將血液滴入2～3個盛有5ml培養液（4mlrpmil640、lml小牛血清，5mgpha，用5％的nahco3調ph至7.0～7.4）的培養瓶內，每瓶0.2～0.3ml（7號針頭13滴），蓋上橡皮塞，輕輕搖動以混勻。
（二）培養
1．將培養瓶放在37℃恒溫箱內培養72h。
2．在終止培養前2～4h，將0.01％的秋水仙素1～2滴（7號針頭）加入培養瓶內，輕輕搖勻．放回溫箱內，繼續培養2～4h。
（三）收獲
1．用吸管充分吹打瓶壁，吸取培養物移入刻度離心管內，相對離心管平衡后放入離心機，離心8min（1000轉/分），吸去上清液，留下沉淀物。
2．低滲處理：加8ml預溫（370c）的0.075mol。l-1kci低滲液，用吸管打勻使細胞懸
浮于低滲液中，放回37℃恒溫水浴鍋中，靜置15～20min，使白細胞膨脹，染色體分散、
紅細胞解體。
3．預固定：加入固定液1～2ml打勻。
4．再離心：1000轉/分離心8min，吸去上清液，留下沉淀物。
5．固定：沿離心管壁加入新配固定液8ml打勻，固定30min。
6．再離心：1000轉/分離心8min，棄去上清液，留下沉淀物。
7．再固定：再加入新配固定液8ml，打勻，靜置30min。
8．再離心：1000轉/分離心8min，棄去上清液。
9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打勻成細胞懸液。
10．制片：用滴管吸細胞懸液2～3滴，滴在冰水預浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，在酒精燈上過幾次，吹風機吹干或氣干。
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1．pha是體外淋巴細胞培養成敗的關鍵問題，因此，要考慮它的質量和濃度。鹽水提取物一般冰凍保存的時間不宜過長，時間長了效價減低。
2．濃度一般用1％～2％，每毫升培養液加0.2～0.4ml；濃度過高可能會導致紅細胞凝集。
3．秋水仙素溶液濃度和處理時間。一般zui終濃度每毫升培養液0.1～0.2μg為宜，作用時間為3～5h，一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關系。如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態特征模糊。
4．培養溫度應嚴格控制在37℃+0.5℃。
5．雙蒸水必須用玻璃蒸餾器制備，ph應在6～7之間。
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7．離心機用水平式的，速度不宜過快。速度太快細胞團不易打散，反之分裂相易丟失；固定液應在臨用時新鮮配制，固定一定要、均勻。若打散不夠，則細胞在玻片上易集結。
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10．操作過程應保持高度無菌概念，嚴防細菌和病毒污染；在外周血培養中，pha對淋巴細胞的作用，個體差異較大。同樣方法和條件，分裂相多少及分散情況不一樣。因此，若失敗，應充分考慮到這些因素。
（五）預期實驗結果及分析
將制作好的片子在油鏡下仔細觀察，選擇較好的分裂相進行照相、剪貼、分組，將照片上的核型進行剪貼，寫出實驗報告與實驗結果。
染色體數目為46xx，（xy）為人類正常核型。若某對染色體少了一條（2n-1），細胞染色體數目為45；或某一對染色體多了一條（2n+1），細胞染色體數目為47；若為兩種核型，46，xx/46，xxy稱為嵌合體。以上三種為異常核型。
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